3.1.2 Azidi
L’azide è considerata come uno dei gruppi più adatti per le reazioni bioortogonali e la chimica del clic. A differenza dei chetoni e delle aldeidi, non ci sono quasi mai azidi presenti nei sistemi biologici. Le azidi possiedono un’elevata energia intrinseca ma nessun partner di reazione naturale (King e Wagner, 2014), hanno piccole dimensioni e carica complessiva neutra, e infine sono cineticamente stabili in condizioni fisiologiche.
La legatura di Staudinger (Staudinger e Hauser, 1921) sembra essere un buon candidato per le reazioni di bioconjugation utilizzando le azidi. In questa reazione, gli azidi reagiscono con reagenti trifenilfosfina contenenti una trappola elettrofila per produrre un intermedio aza-ilide che reagisce con il gruppo carbonilico estere elettrofilo formando un anello a cinque membri che subisce l’idrolisi per generare un legame ammidico stabile finale (Fig. 5.6A) (Steen Redeker et al., 2013; Staudinger e Hauser, 1921). Una nuova variante di questa reazione è stata descritta poco dopo (King e Wagner, 2014; Saxon e Bertozzi, 2000; Saxon et al., 2000; Nilsson et al., 2000), indicata come “legatura di Staudinger senza tracciatura”, in cui il prodotto finale legato all’ammide viene liberato dalla proprietà dell’ossido di fosfina.
Figura 5.6. Esempi di reazioni di bioconiugazione con azidi. (A) Legatura di Staudinger; (B) azide-alchine cicloaddizione catalizzata dal rame; (C) ceppo-promosso azide-alchine cicloaddition; (D) cycloaddition con oxanorbornadienes. UAA, aminoacidi innaturali.
La legatura di Staudinger è stata impiegata in una varietà di applicazioni. Per esempio, Raines et al. hanno applicato questa reazione come alternativa senza cisteina a NCL per la legatura dei peptidi (Nilsson et al., 2001) e in combinazione con NCL nell’assemblaggio di RNAase A artificiale (Nilsson et al., 2005). Inoltre, è stato utilizzato in altre applicazioni, come l’immobilizzazione di proteine su supporto solido per l’imaging in vitro e in vivo (Saxon e Bertozzi, 2000; Prescher et al., 2004), etichettatura di biomolecole in vitro e in vivo (Saxon e Bertozzi, 2000; Prescher et al, 2004; Vocadlo et al., 2003), arricchimento di proteine (Vocadlo et al., 2003) e rilevamento (Charron et al., 2009), così come (Lemieux et al., 2003) modifica delle proteine.
Nonostante, la legatura Staudinger ha alcuni svantaggi. Vale a dire, la sua cinetica lenta (costante di tasso di secondo ordine nel basso range 10-3 M-1s-1) (Lin et al., 2005), la labilità di ossidazione dei composti di fosfina (necessità di utilizzare concentrazioni relativamente alte del reagente fosfina), e il potenziale di reattività incrociata delle fosfine con i disolfuri (Lang e Chin, 2014; King e Wagner, 2014).
Gli azidi possono reagire con gli alchini in una cicloaddizione azido-alchinica (CuAAC) o 1,3-dipolare catalizzata da Cu(I) (Fig. 5.6B), uno degli esempi più standard di reazioni di click chemistry (Rostovtsev et al, 2002; Tornøe et al., 2002). Questa reazione presenta un alto interesse nelle scienze biologiche a causa della sua buona selettività, alta resa e condizioni di reazione miti (temperatura ambiente in vari solventi). Inoltre, sia gli azidi che gli alchini sono introdotti nelle proteine senza influenzare la struttura e la funzione della proteina (Steen Redeker et al., 2013). L’azide e l’alchina possono formare molto velocemente un legame 1,2,3-triazolo stabile in condizioni fisiologiche, in presenza di Cu(I). Il meccanismo proposto da Sharpless et al. (Rostovtsev et al., 2002) descrive prima l’introduzione dell’alchina terminale in un acetilide di rame e un successivo attacco dell’azide (King e Wagner, 2014). Recentemente, questo meccanismo è stato ulteriormente raffinato ed è stato proposto un intermedio dicopper (Worrell et al., 2013). I principali inconvenienti di questa reazione sono le reazioni collaterali Cu (I) dipendenti e il Cu (I) citotossicità (Baskin et al., 2007; Plass et al., 2011), che hanno limitato la sua applicazione principalmente per l’etichettatura nello spazio extracellulare (Re e Wagner, 2014). CuAAC è stato ampiamente utilizzato in molti studi biologici diversi, per esempio, per etichettare i fosfolipidi per il loro imaging in vivo (Jao et al., 2009) e in vitro (Neef e Schultz, 2009), per virus rimodellamento della superficie (Steinmetz et al, 2009), per modificare/etichettare le proteine in vitro e in vivo (Link e Tirrell, 2003; Ngo e Tirrell, 2011; Liu e Schultz, 2010; Deiters et al., 2003), per etichettare gli acidi nucleici (Weisbrod e Marx, 2008), e il profiling della sonda basato sull’affinità (Speers et al., 2003).
Diversi approcci sono stati sviluppati per superare la citotossicità del rame. Vale a dire, l’uso di ligandi idrosolubili per la coordinazione di Cu(I), l’uso di azidi organiche chelanti il rame, e l’introduzione di un ceppo dell’anello nella moiety dell’alchina. Nel primo caso, i ligandi solubili in acqua coordinano Cu(I) per formare un catalizzatore di rame attivato in grado di promuovere la CuAAC a basse concentrazioni micromolari di metallo riducendo allo stesso tempo la potenziale tossicità di Cu(I) (Besanceney-Webler et al., 2011; Del Amo e Wang, 2010; Hong et al., 2009; Kennedy et al., 2011). Nel secondo caso, la concentrazione effettiva di Cu(I) viene aumentata nel sito di reazione utilizzando ligandi azidici contenenti una parte interna di rame-chelante (Brotherton et al., 2009; Kuang et al., 2010; Uttamapinant et al., 2012). L’ultima strategia prevede l’uso di alchini, che sono stati attivati per reagire con una cinetica migliorata in assenza di catalizzatore. A questo proposito, l’uso di moieties di cicloottine aumenta la reattività come risultato del rilascio del ceppo (Steen Redeker et al., 2013; Baskin et al., 2007; Plass et al., 2011). Il ceppo-promosso azide-alchilene cycloaddition (SPAAC) (Fig. 5.6C) è diventato un potente strumento non solo per l’etichettatura di proteine e anticorpi, ma anche per altre applicazioni come l’analisi Western Blot senza anticorpi (Boutureira et al., 2015) perché non sono richiesti reagenti aggiuntivi o metalli tossici che possono danneggiare le biomolecole. Per esempio, Bertozzi et al. hanno dimostrato la sua applicabilità sulla modifica delle proteine purificate (Baskin et al., 2007). In ulteriori esperimenti, la reazione è stata applicata con successo in vitro a cellule di fibroblasti (Baskin et al., 2007). Inoltre, lo SPAAC è stato utilizzato per l’immagine di tumori in topi viventi con l’aiuto di nanoparticelle (Koo et al., 2012) e 18F PET dove il fluoro è stato attaccato sia all’azide che al cicloalchilene (Jeon et al., 2012). Altri campi di applicazione sono stati trovati nella modifica dei virus e nell’etichettatura del DNA (Qiu et al., 2013). Tuttavia, la complessa sintesi delle ciclochine e i fatti che la loro maggiore voluminosità e idrofobicità può influenzare la struttura e la stabilità delle proteine (Kim et al, 2013), e la loro maggiore attivazione può promuovere reazioni collaterali con tioli presenti in natura possono essere considerati come svantaggi.
Le sulfonil azidi prive di elettroni possono anche reagire con alcheni attivati (ossanorbornadieni o norborneni) in una cicloaddizione senza metallo (Fig. 5.6D), simile alla SPAAC (Alder, 1930; Huisgen et al., 1980). Tuttavia, il prodotto delle cicloaddizioni azide-alcene è una triazolina relativamente instabile a differenza dei triazoli aromatici che si formano nella cicloaddizione classica di click. Un oxanorbornadiene che è sia teso che carente di elettroni è stato usato come dipolofilo in una reazione con azidi (van Berkel et al., 2008). In questo caso, il doppio legame teso nell’oxanorbornadiene reagisce con gli azidi per formare una triazolina intermedia che spontaneamente subisce una reazione Diels-Alder retro, con rilascio di furano, portando a stabili 1,2,3 o 1,4,5-triazoli. Questa reazione è stata usata per bioconiugare selettivamente una proteina funzionalizzata con oxanorbornadiene e un peptide ciclico modificato con azide in tamponi acquosi. Anche se gli oxanorbornadieni sono più facili da sintetizzare rispetto alle loro controparti cicloctyne, questa reazione di cicloaddizione è piuttosto lenta e non del tutto chemielettiva rispetto ad altri gruppi funzionali che si trovano nelle proteine, il che può aver limitato il suo uso diffuso (Lang e Chin, 2014; van Berkel et al., 2008).