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Abstract

La frequenza, i fattori di rischio e il risultato della batteriemia gram-negativa policlonale sono ancora sconosciuti. Li abbiamo studiati in uno studio di coorte prospettico di pazienti per i quali una coltura del sangue ha prodotto ⩾1 specie di gram-negativi aerobi. Per ogni paziente, l’elettroforesi in campo pulsato (PFGE) è stata eseguita su 4 colonie di ogni tipo morfologico. Gli episodi di batteriemia sono stati considerati policlonali se causati da >1 tipo PFGE della stessa specie. Dieci (6,5%) dei 153 pazienti esaminati avevano una batteriemia policlonale. La batteriemia dovuta a bastoncini non fermentanti era il singolo fattore di rischio significativo per la batteriemia policlonale. Le complicazioni erano ugualmente frequenti in tutti i gruppi di pazienti. Tuttavia, i pazienti con batteriemia policlonale hanno ricevuto una terapia antibiotica più estesa rispetto ai pazienti con batteriemia monoclonale. Quasi il 20% degli episodi di batteriemia dovuti a bastoncini non fermentanti erano policlonali, ma rimane poco chiaro perché i bastoncini non fermentanti avevano più probabilità di causare la batteriemia policlonale rispetto ad altri bastoncini gram-negativi.

La batteriemia gram-negativa è un’infezione grave con un tasso di mortalità grezzo stimato del 20%-50%. Pertanto, i fattori di rischio per lo sviluppo della sepsi, la storia naturale della malattia e soprattutto la terapia sono stati ampiamente studiati. I moderni strumenti molecolari sono stati raramente utilizzati per studiare la sepsi. In alcuni degli studi successivi, sono stati descritti episodi di batteriemia dovuti a genotipi >1 della stessa specie. Arbeit et al. hanno usato il termine “batteriemia policlonale” per descrivere questi episodi di batteriemia.

Un precedente studio retrospettivo ha rivelato che i pazienti che avevano una batteriemia gram-negativa policlonale avevano più spesso gravi condizioni di base rispetto ai pazienti che avevano una batteriemia monoclonale. Inoltre, più pazienti che avevano la batteriemia policlonale sono morti a causa della batteriemia. Tuttavia, il disegno dello studio retrospettivo può essere soggetto a notevoli distorsioni. Pertanto, abbiamo eseguito uno studio di coorte prospettico per stimare la frequenza della batteriemia policlonale e per indagare i fattori di rischio e l’esito della batteriemia policlonale.

Pazienti e metodi

Pazienti. L’Universitätsklinikum Benjamin Franklin è un ospedale terziario di 1300 letti con ∼34.000 ricoveri all’anno. Sono stati inclusi nello studio tutti i pazienti che avevano ⩾1 specie di bastoncini gram-negativi a crescita aerobica isolati da ⩾1 emocoltura raccolta nel periodo agosto 1996-luglio 1997.

Un ricercatore, che era cieco ai risultati della tipizzazione, ha estratto i seguenti dati dalla cartella clinica di ogni paziente: età, sesso, servizio ospedaliero dove sono stati trattati, malattie di base, gravità della malattia di base come valutato dai criteri McCabe e Jackson (rapidamente fatale, si prevede di morire entro 12 mesi; infine fatale, si prevede di vivere >12 mesi ma morire entro 4 anni; non fatale, si prevede di vivere >4 anni), punteggio Karnofsky, acute physiology and chronic health evaluation (APACHE II) score, fonte di batteriemia, complicazioni, terapia, e risultato.

Poiché lo studio originale che descriveva il punteggio APACHE II non includeva i bambini, il punteggio è stato calcolato solo per persone di età >16 anni. Sono stati raccolti dati sui possibili fattori di rischio per la batteriemia, compresi i seguenti: esecuzione di procedure operative; necessità di emodialisi; presenza di corpi estranei e/o posizionamento di cateteri intravascolari o urinari; necessità di ventilazione meccanica per ⩾24 ore. Un sito corporeo è stato considerato fonte di batteriemia se la stessa specie di batteri è stata isolata da quel sito e dall’emocoltura o se un’infezione locale è stata diagnosticata mediante radiologia, mediante ecografia o durante le procedure chirurgiche. I criteri di sepsi definiti dalla conferenza di consenso dell’American College of Chest Physicians e della Society of Critical Care Medicine sono stati utilizzati per valutare le risposte sistemiche dei pazienti alla batteriemia. Le cartelle cliniche sono state esaminate per determinare se il paziente ha sviluppato una delle seguenti complicazioni: shock settico, sindrome da distress respiratorio adulto, insufficienza renale, coagulazione intravascolare disseminata, insufficienza multiorgano o morte per batteriemia. La durata della terapia antimicrobica è stata definita come il periodo di tempo dal primo giorno di terapia antimicrobica all’ultimo giorno di terapia. Per ogni paziente, il numero totale di giorni di terapia antibiotica è stato calcolato sommando la durata della terapia per tutti gli agenti antimicrobici che il paziente ha ricevuto; la terapia antimicrobica profilattica non è stata inclusa nel calcolo.

Organismi. Il laboratorio di microbiologia (presso l’Universitätsklinikum Benjamin Franklin) ha utilizzato emocolture in brodo per elaborare campioni di sangue (Septicheck; Becton Dickinson). Dalle emocolture che avevano coltivato i bastoncini gram-negativi, sono state ulteriormente elaborate 4 colonie di ogni tipo morfologico. I sistemi API 20E e API 20NE (bioMérieux) sono stati utilizzati per identificare gli isolati a livello di specie. Gli isolati sono stati conservati congelati a -70°C in brodo di glicerina.

Tipolazione molecolare. Il metodo dell’elettroforesi a campo pulsato (PFGE) descritto da Pfaller et al. è stato utilizzato per la tipizzazione degli isolati. Dopo aver passato ogni isolato almeno due volte su agar sangue, le colonie sono state inoculate in brodo di soia con tripticasi e le colture sono state incubate per una notte. I batteri sono stati incorporati in agarosio e il DNA cromosomico è stato digerito con l’enzima di restrizione appropriato: XbaI per Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Xanthomonas maltophilia; SpeI per Enterobacter species, Klebsiella species, Proteus species, Serratia marcescens e altre Enterobacteriaceae; SmaI per Haemophilus influenzae; e AscI per Acinetobacter species. I frammenti sono stati separati mediante PFGE e i gel sono stati colorati con bromuro di etidio. Se tutte le bande maggiori e minori corrispondevano esattamente, gli isolati sono stati classificati come identici. Se almeno il 90% ma <100% delle bande corrispondeva (cioè, 1-3 bande differivano), gli isolati sono stati considerati simili. Se <90% delle bande corrispondevano (cioè, >3 bande differivano) gli isolati sono stati considerati ceppi diversi. Una batteriemia è stata definita policlonale se ⩾2 ceppi diversi della stessa specie gram-negativa sono stati identificati in una singola emocoltura.

Test di sensibilità. La suscettibilità antimicrobica è stata testata per mezzo di una diluizione in microbrodo utilizzando il metodo del punto di rottura. Utilizzando piastre di microtitolazione e mezzi da noi preparati (brodo IsoSensitest; Unipath), abbiamo testato la suscettibilità degli isolati ai seguenti agenti antimicrobici: ampicillina, ampicillina-sulbactam, piperacillina, mezlocillina, cefotiam, cefotaxime, ceftriaxone, cefaclor, ceftazidime, imipenem, meropenem, trimetoprim-sulfametossazolo, gentamicina, tobramicina, ofloxacin, ciprofloxacin, tetraciclina, amikacin, e fosfomicina. I profili di resistenza agli antibiotici dei ceppi con diversi tipi PFGE ottenuti dallo stesso paziente sono stati confrontati. Per ogni 2 tipi PFGE, era necessaria una differenza nella categoria interpretativa (suscettibile vs. resistente) per ⩾1 antibiotico perché i profili antibiotici fossero considerati diversi.

Analisi statistica. Se la cartella clinica di un paziente mancava di dati per >40% delle categorie o se non siamo stati in grado di digitare gli isolati dell’emocoltura, il paziente è stato escluso dall’analisi. Abbiamo usato il test χ2 o il test esatto di Fisher per valutare le differenze tra le variabili categoriche e il test Mann-Whitney U, per valutare le differenze tra le variabili continue (SPSS). Abbiamo fissato α a 0,05, e abbiamo eseguito test a 2 code.

Risultati

Durante il periodo di studio, 169 pazienti hanno avuto un episodio di batteriemia gram-negativa. Sedici pazienti sono stati esclusi da ulteriori analisi, 9 pazienti perché mancavano i dati per >40% delle categorie, e 7 pazienti perché non siamo stati in grado di digitare gli isolati dell’emocoltura. I pazienti con dati mancanti sono stati trasferiti in altri ospedali poco dopo aver ottenuto un campione di sangue per la coltura; pertanto, la maggior parte dei dati mancava nelle cartelle cliniche. I pazienti esclusi non erano diversi dai pazienti inclusi per quanto riguarda l’età, il sesso, il servizio ospedaliero dove sono stati trattati, o la specie microbica che ha causato l’episodio di batteremia.

Dei 153 pazienti che sono stati inclusi nell’analisi, 47 pazienti avevano batteriemia polimicrobica. Gli episodi di batteriemia polimicrobica sono stati causati da combinazioni di bastoncini gram-negativi e cocchi gram-positivi (stafilococchi coagulasi-negativi, enterococchi o Staphylococcus aureus) in 27 pazienti. Alcuni pazienti hanno avuto una batteriemia polimicrobica causata da combinazioni di bastoncini gram-negativi e funghi (2 pazienti), bastoncini gram-negativi e vari organismi anaerobi (6 pazienti), o bastoncini gram-negativi e gram-positivi (3 pazienti). Nove pazienti avevano una batteriemia polimicrobica dovuta a 2 diverse specie gram-negative. Pertanto, 162 isolati subculturati di bastoncini gram-negativi erano disponibili per la tipizzazione. Escherichia coli, specie di Klebsiella e specie di Enterobacter erano le specie gram-negative più frequentemente isolate (tabella 1). Dieci episodi di batteriemia (6,5%) erano policlonali, cioè gli episodi erano causati da 2 tipi PFGE della stessa specie. Cinque dei pazienti che avevano una batteriemia policlonale avevano anche una batteriemia polimicrobica. Gli episodi di batteriemia policlonale erano significativamente più spesso causati da bastoncini non fermentanti che dalla batteriemia monoclonale o polimicrobica.

I pazienti con batteriemia policlonale sono stati confrontati con pazienti con batteriemia monoclonale e con pazienti con batteriemia polimicrobica. I 5 pazienti che avevano sia batteriemia polimicrobica che policlonale sono stati esclusi dall’analisi per evitare errori di classificazione. I pazienti che avevano una batteriemia policlonale avevano la stessa distribuzione di età, sesso e numero di malattie sottostanti dei pazienti che avevano una batteriemia monoclonale e di quelli che avevano una batteriemia polimicrobica (tabella 2). La gravità e la prognosi delle malattie sottostanti erano simili in tutti i gruppi di pazienti.

Per tutti i gruppi di pazienti, più della metà degli episodi di batteriemia sono stati acquisiti in ospedale, e ∼10 sono stati acquisiti durante il trattamento in un reparto di terapia intensiva. La durata media della degenza ospedaliera prima dello sviluppo della batteriemia era maggiore per i pazienti che avevano una batteriemia policlonale (17 giorni) rispetto ai pazienti che avevano una batteriemia monoclonale (11 giorni) e ai pazienti che avevano una batteriemia polimicrobica (9 giorni); tuttavia, questa differenza non era significativa. In tutti i gruppi di pazienti, la proporzione di pazienti che erano ventilati meccanicamente o che avevano un catetere venoso centrale o urinario era simile. Il tratto urinario era la fonte più frequente di batteremia tra i pazienti che avevano una batteriemia monoclonale o policlonale. Tra i pazienti che avevano una batteriemia polimicrobica, i processi intra-addominali (ad esempio, diverticolite) erano la fonte più frequente di batteriemia.

Quasi tutti i pazienti erano sintomatici durante il loro episodio di batteriemia e soddisfacevano i criteri per la sepsi (tabella 3). La frequenza delle complicazioni durante l’episodio di batteriemia era bassa in tutti i gruppi di pazienti, e solo 10 dei pazienti che avevano una batteriemia monoclonale e 12 dei pazienti che avevano una batteriemia polimicrobica sono morti entro 7 giorni dalla prima emocoltura positiva. Nessuno dei pazienti che aveva una batteriemia policlonale è morto per batteriemia.

I pazienti che avevano una batteriemia policlonale sono rimasti in ospedale più a lungo dopo l’episodio rispetto ai pazienti con batteriemia monoclonale o polimicrobica (media, 48 giorni contro 27 giorni e 48 giorni contro 30 giorni, rispettivamente); tuttavia, questa associazione non ha raggiunto la significatività statistica. I pazienti che avevano una batteriemia policlonale hanno ricevuto più antibiotici e sono stati trattati più a lungo rispetto ai pazienti che avevano una batteriemia monoclonale. Il numero totale di giorni di terapia antibiotica era significativamente più alto per i pazienti che avevano una batteriemia policlonale rispetto a quelli che avevano una batteriemia monoclonale (P = .02). Il trattamento antibiotico non differiva significativamente tra i pazienti che avevano una batteriemia policlonale e i pazienti che avevano una batteriemia polimicrobica.

Quattro delle 10 coppie di isolati che avevano diversi modelli PFGE avevano anche diversi modelli di suscettibilità antimicrobica. I modelli differivano nella suscettibilità a 1-5 agenti antibiotici. In tutti questi casi, il laboratorio di microbiologia aveva riportato la suscettibilità del ceppo più resistente. Così, tutti i pazienti hanno ricevuto una terapia appropriata.

Discussione

Frequenza. A nostra conoscenza, la frequenza della batteriemia gram-negativa policlonale non è stata studiata prima. Tuttavia, diversi ricercatori hanno valutato episodi di batteriemia polimicrobica. Quindi, la proporzione di episodi di batteriemia che sono polimicrobici è nota per variare dal 6% al 21%. Tuttavia, i risultati di questi studi sono difficili da confrontare perché i ricercatori hanno usato diverse definizioni di batteriemia polimicrobica. In generale, la maggior parte degli studi ha definito gli episodi di batteriemia polimicrobica come quelli in cui >1 specie sono state isolate dallo stesso campione di sangue. Usando questa definizione, una proporzione leggermente più alta (31%) della nostra popolazione di pazienti che avevano ⩾1 specie gram-negative isolate dalla coltura del sangue aveva una batteriemia polimicrobica.

In 9 (19%) dei 47 pazienti, la batteriemia polimicrobica era causata da 2 diversi bastoncini gram-negativi. Altri ricercatori hanno trovato un tasso simile di batteriemia dovuta a ⩾2 bastoncini gram-negativi nel 9%-28% dei pazienti con batteriemia polimicrobica. Nella nostra popolazione di studio, gli episodi di batteriemia policlonale gram-negativa erano altrettanto frequenti degli episodi di batteriemia dovuti a 2 specie di bastoncini gram-negativi (6,5% vs 5,8%, rispettivamente).

Fattori di rischio. Sono stati riportati solo pochi casi di batteriemia policlonale. Quindi, nessuna informazione era disponibile sui fattori di rischio per la batteriemia policlonale. Nella nostra popolazione di studio, l’organismo che causa la batteriemia era l’unico fattore di rischio significativo associato alla batteriemia policlonale.

Outcome. Nessuno dei pazienti che abbiamo studiato e che ha avuto una batteriemia policlonale è morto a causa dell’episodio di batteriemia. Questo non era significativamente diverso dal basso tasso di mortalità tra i pazienti che avevano una batteriemia monoclonale e tra quelli che avevano una batteriemia polimicrobica. Altri studi hanno trovato che i pazienti con episodi di batteriemia polimicrobica avevano un tasso di mortalità più alto rispetto ai pazienti con episodi di batteriemia monomicrobica. Il numero di pazienti con batteriemia policlonale documentata può essere ancora troppo basso per trarre conclusioni sul tasso di mortalità associato alla batteriemia policlonale.

I pazienti che avevano una batteriemia policlonale sono rimasti in ospedale per un tempo più lungo dopo il loro episodio di batteriemia e hanno ricevuto una terapia antibiotica più estesa rispetto ai pazienti che avevano una batteriemia monoclonale. Tuttavia, il nostro piccolo gruppo di pazienti non ci ha permesso di analizzare se la permanenza in ospedale più lunga e la terapia più estesa derivassero dalla batteriemia policlonale o dalla malattia sottostante dei pazienti.

Microbiologia. Colpisce il fatto che quasi un quarto di tutti gli episodi di batteriemia dovuti a bastoncini non fermentanti erano policlonali. Non abbiamo studiato i fattori di virulenza degli organismi causali, ma sembra possibile che alcuni organismi (ad esempio, i bastoncini non fermentanti) abbiano caratteristiche speciali che promuovono lo sviluppo della batteriemia policlonale.

Quasi la metà degli episodi di batteriemia policlonale erano causati da ceppi batterici che avevano diversi profili di suscettibilità antimicrobica. In altri rapporti di infezioni policlonali, isolati appaiati da una metà dei pazienti avevano anche diversi modelli di suscettibilità antimicrobica. Pertanto, la pratica di laboratorio di identificare e testare isolati con diversi tipi morfologici dalla stessa emocoltura ha chiaramente un merito. Se i microbiologi testano solo 1 ceppo suscettibile isolato da un paziente con un episodio di batteriemia policlonale, la terapia che segue può selezionare il ceppo resistente. Questo potrebbe essere frainteso come lo sviluppo di resistenza durante la terapia antibiotica, anche se l’acquisizione de novo di resistenza è un incidente raro, che si verifica nel <10% delle ricadute.

In conclusione, la batteriemia policlonale può essere più simile alla batteriemia polimicrobica che alla batteriemia monoclonale per quanto riguarda il risultato. Pertanto, in ulteriori studi sull’esito della batteriemia, i pazienti che hanno batteriemia policlonale potrebbero dover essere analizzati separatamente.

Riconoscimenti

Ringraziamo Dagmar Löffler per la sua eccellente assistenza tecnica con la genotipizzazione.