3.1.2 Azidy
Azidy jsou považovány za jednu z nejvhodnějších skupin pro bioortogonální reakce a click chemii. Na rozdíl od ketonu a aldehydu se azidy v biologických systémech téměř nevyskytují. Azidy mají vysokou vnitřní energii, ale nemají žádného přirozeného reakčního partnera (King a Wagner, 2014), mají malé rozměry a neutrální celkový náboj a konečně jsou kineticky stabilní za fyziologických podmínek.
Staudingerova ligace (Staudinger a Hauser, 1921) se jeví jako dobrý kandidát pro biokonjugační reakce s využitím azidů. Při této reakci reagují azidy s trifenylfosfinovými činidly obsahujícími elektrofilní past za vzniku aza-ilidového meziproduktu, který reaguje s elektrofilní esterovou karbonylovou skupinou za vzniku pětičlenného kruhu, který podléhá hydrolýze za vzniku konečné stabilní amidové vazby (obr. 5.6A) (Steen Redeker a kol., 2013; Staudinger a Hauser, 1921). Krátce poté byla popsána nová varianta této reakce (King a Wagner, 2014; Saxon a Bertozzi, 2000; Saxon a kol., 2000; Nilsson a kol., 2000), označovaná jako „bezestopá Staudingerova ligace“, kde se konečný produkt s amidovou vazbou uvolňuje z fosfinoxidové části
Obrázek 5.6. Příklady biokonjugačních reakcí s azidy. (A) Staudingerova ligace; (B) mědí katalyzovaná azido-alkynová cykloadice; (C) kmenem podporovaná azido-alkynová cykloadice; (D) cykloadice s oxanorbornadieny. UAA, nepřirozené aminokyseliny.
Staudingerova ligace byla použita v různých aplikacích. Například Raines a kol. použili tuto reakci jako alternativu NCL bez cysteinu pro ligování peptidů (Nilsson a kol., 2001) a v kombinaci s NCL při sestavování umělé RNAázy A (Nilsson a kol., 2005). Kromě toho byla použita v dalších aplikacích, jako je imobilizace proteinů na pevném nosiči pro zobrazování in vitro a in vivo (Saxon a Bertozzi, 2000; Prescher et al., 2004), značení biomolekul in vitro a in vivo (Saxon a Bertozzi, 2000; Prescher et al., 2004; Vocadlo a kol., 2003), obohacování proteinů (Vocadlo a kol., 2003) a detekce (Charron a kol., 2009), jakož i (Lemieux a kol., 2003) modifikace proteinů.
Naproti tomu má Staudingerova ligace některé nevýhody. Konkrétně se jedná o jeho pomalou kinetiku (rychlostní konstanta druhého řádu v nízkém rozsahu 10-3 M-1s-1) (Lin et al., 2005), oxidační labilita fosfinových sloučenin (nutnost použití relativně vysokých koncentrací fosfinového činidla) a potenciální zkřížená reaktivita fosfinů s disulfidy (Lang a Chin, 2014; King a Wagner, 2014).
Azidy mohou reagovat s alkyny v Cu(I)-katalyzované azid-alkynové cykloadici (CuAAC) nebo 1,3-dipolární cykloadici (obr. 5.6B), což je jeden z nejstandardnějších příkladů reakcí click chemie (Rostovtsev a kol..), 2002; Tornøe et al., 2002). Tato reakce představuje velký zájem v biologických vědách pro svou dobrou selektivitu, vysoký výtěžek a mírné reakční podmínky (pokojová teplota v různých rozpouštědlech). Navíc se azidy i alkyny zavádějí do proteinů bez ovlivnění jejich struktury a funkce (Steen Redeker a kol., 2013). Azid a alkyn mohou za fyziologických podmínek v přítomnosti Cu(I) vytvořit velmi rychle stabilní 1,2,3-triazolovou vazbu. Mechanismus navržený Sharplessem a spol. (Rostovtsev a spol., 2002) popisuje nejprve zavedení terminálního alkynu do acetylidu mědi a následný atak azidu (King a Wagner, 2014). Nedávno byl tento mechanismus dále upřesněn a byl navržen dikopný meziprodukt (Worrell a kol., 2013). Hlavními nevýhodami této reakce jsou vedlejší reakce závislé na Cu(I) a cytotoxicita Cu(I) (Baskin a kol., 2007; Plass a kol., 2011), které omezily její použití především pro značení v extracelulárním prostoru (King a Wagner, 2014). CuAAC se široce používá v mnoha různých biologických studiích, například ke značení fosfolipidů pro jejich zobrazování in vivo (Jao et al., 2009) a in vitro (Neef a Schultz, 2009), k remodelaci povrchu virů (Steinmetz et al…, 2009), k modifikaci/značení proteinů in vitro a in vivo (Link a Tirrell, 2003; Ngo a Tirrell, 2011; Liu a Schultz, 2010; Deiters a kol., 2003), ke značení nukleových kyselin (Weisbrod a Marx, 2008) a k profilování sond na základě afinity (Speers a kol., 2003).
K překonání cytotoxicity mědi byly vyvinuty různé přístupy. Konkrétně se jedná o použití ve vodě rozpustných ligandů pro koordinaci Cu(I), použití organických azidů chelatujících měď a zavedení kruhového napětí do alkynové části. V prvním případě ve vodě rozpustné ligandy koordinují Cu(I) za vzniku aktivovaného měďnatého katalyzátoru, který je schopen podporovat CuAAC při nízkých mikromolárních koncentracích kovu a zároveň snižuje potenciální toxicitu Cu(I) (Besanceney-Webler a kol., 2011; Del Amo a Wang, 2010; Hong a kol., 2009; Kennedy a kol., 2011). Ve druhém případě se efektivní koncentrace Cu(I) v místě reakce zvyšuje použitím azidových ligandů obsahujících vnitřní měď-chelatační část (Brotherton a kol., 2009; Kuang a kol., 2010; Uttamapinant a kol., 2012). Poslední strategie zahrnuje použití alkynů, které byly aktivovány tak, aby reagovaly s lepší kinetikou v nepřítomnosti katalyzátoru. V tomto ohledu použití cyklooktynových částí zvyšuje reaktivitu v důsledku uvolnění kruhového tahu (Steen Redeker et al., 2013; Baskin et al., 2007; Plass et al., 2011). Kmenem podporovaná azido-alkynová cykloadice (SPAAC) (obr. 5.6C) se stala mocným nástrojem nejen pro značení proteinů a protilátek, ale také pro další aplikace, jako je analýza Western Blot bez protilátek (Boutureira et al., 2015), protože nejsou zapotřebí další činidla nebo toxické kovy, které mohou poškodit biomolekuly. Například Bertozzi a kol. prokázali jeho použitelnost na modifikaci purifikovaných proteinů (Baskin a kol., 2007). V dalších experimentech byla reakce úspěšně aplikována in vitro na buňky fibroblastů (Baskin et al., 2007). Dále byla SPAAC použita k zobrazení nádorů u živých myší pomocí nanočástic (Koo et al., 2012) a 18F PET, kde byl fluor navázán na azid i cykloalkyn (Jeon et al., 2012). Další oblasti použití byly nalezeny při modifikaci virů a značení DNA (Qiu et al., 2013). Složitá syntéza cyklokyanů a skutečnosti, že jejich zvýšená objemnost a hydrofobicita může ovlivnit strukturu a stabilitu proteinů (Kim et al., 2013) a jejich zvýšená aktivace může podporovat vedlejší reakce s přirozeně se vyskytujícími thioly, lze považovat za nevýhody.
Elektronově deficitní sulfonyl azidy mohou také reagovat s aktivovanými alkeny (oxanorbornadiony nebo norborneny) v cykloadici bez použití kovů (obr. 5.6D), podobně jako SPAAC (Alder, 1930; Huisgen a kol., 1980). Produktem azid-alkenové cykloadice je však relativně nestabilní triazolin na rozdíl od aromatických triazolů vznikajících při klasické click cykloadici. Oxanorbornadien, který je napjatý a zároveň elektronově deficitní, byl použit jako dipolarofil v reakci s azidy (van Berkel a kol., 2008). V tomto případě napjatá dvojná vazba v oxanorbornadienu reaguje s azidy za vzniku meziproduktu triazolinu, který spontánně prochází retro Diels-Alderovou reakcí s uvolněním furanu, což vede ke stabilním 1,2,3- nebo 1,4,5-triazolům. Tato reakce byla použita k selektivní biokonjugaci proteinu s oxanorbornadienovou funkcí a cyklického peptidu modifikovaného azidy ve vodných pufrech. Ačkoli se oxanorbornadieny syntetizují snadněji než jejich cyklooktynové protějšky, tato cykloadiční reakce je poměrně pomalá a ne zcela chemoselektivní vůči jiným funkčním skupinám vyskytujícím se v proteinech, což mohlo omezit její široké využití (Lang a Chin, 2014; van Berkel a kol., 2008).
.