1 ÚVOD
Fosfolipidové dvojvrstvy (BLM) představují užitečný modelový systém pro zkoumání základních aspektů lipidových dvojvrstev biologických buněčných membrán a zejména pro zkoumání jejich elastických vlastností. Jsou to samouspořádané struktury amfipatických molekul s fyzikálními vlastnostmi velmi podobnými vlastnostem smektických kapalných krystalů . Lipidová dvojvrstva je schopna inkorporovat jak hydrofobní, tak amfipatické molekuly, jako jsou proteiny, jiné lipidy, peptidy, steroidy a kosurfaktanty. Pružné vlastnosti lipidových membrán považovaných za spojité prostředí byly využity v řadě studií, od lokálních jevů, jako jsou interakce lipid-lipid , lipid-protein a protein-protein , až po tvarové fluktuace celých buněk . Kromě toho je kapalná uhlovodíková povaha dvojvrstvy udržována mezimolekulárními interakcemi mezi fosfolipidy v nanoskopickém měřítku: elektrostatickými a dipól-dipólovými interakcemi mezi polárními hlavovými skupinami , interakcemi zprostředkovanými molekulami vody a van der Waalsovými disperzními interakcemi mezi uhlovodíkovými řetězci .
Povrchy BLM nejsou dokonale rovinné ani tuhé . Systém BLM je kvazi-dvourozměrná flexibilní struktura, která nepřetržitě prochází různými konformačními a dynamickými přechody . Umělé a přirozené BLM navíc nejsou izolačními systémy, ale jsou propustné pro vodu a elektrolyty, které přes ně difundují různorodými transmembránovými póry.
Stochastické transmembránové póry vznikají jedním z následujících mechanismů: náhodnými a zaujatými tepelnými fluktuacemi (termoporace) a elektrickým spouštěním (elektroporace). Molekuly lipidů uvnitř BLM sledují tři odlišné kategorie náhodných tepelných pohybů: laterální translace, rovnoběžné s povrchem dvojvrstvy, s koeficientem laterální difúze v řádu 10-7 m2s-1 (Dl) , oscilace a rotace kolem os lipidů kolmo k povrchu dvojvrstvy .
Laterální translace s náhodnými směry vyvolávají lokální fluktuace hustoty polárních hlavových skupin lipidů na povrchu dvojvrstvy. Snímek povrchu dvojvrstvy proto odhaluje lokální domény nanoskopických rozměrů s vyšší hustotou polárních hlavových skupin (tj. klastry) i zóny s nižší hustotou. Za určitých fyzikálních podmínek BLM (pH, teplota, lipidové složky, elektrochemický potenciál atd.) představují tyto zóny malé lokální defekty (tj. vakance) membrány. V těchto doménách mohou molekuly vody pronikat do hydrofobní matrice dvojvrstvy. Uvažujme případ dvou nezávislých defektů z každé monovrstvy, které jsou na povrchu membrány uspořádány v kolmém směru. Mohou vytvářet válcovitý hydrofobní pór s vnitřním povrchem lemovaným hydrofobními řetězci lipidů. Proto jsou tyto typy přechodných pórů hydrofobní povahy. Je také možné, že polární hlavové skupiny, které se nacházejí v blízkosti hydrofobního póru, podléhají rotaci směrem do jeho nitra. V tomto případě se vnitřní hydrofobní povrch pórů pokryje polárními hlavovými skupinami. Tyto póry tak mají hydrofilní povahu, nemají již válcovou geometrii a mají větší stabilitu než hydrofobní póry. Jinými slovy, náhodné tepelné fluktuace hustoty polárních hlavových skupin ve dvou monovrstvách BLM jsou schopny vytvářet stochastické transmembránové póry.
Přítomnost fluktuací hydrofobní tloušťky uvnitř BLM byla prokázána jak teorií, tak experimentem. Toho bylo dosaženo stanovením hodnot tloušťky dvojvrstvy (h) ze tří nezávislých postupů: měření elektrické kapacity (hc) , měření optické odrazivosti (hr) a přímého výpočtu (hav). Tanford (1980) vypočítal tloušťku dvojvrstvy podle následujícího vzorce hav = Nl M/ρ, kde Nl, M a ρ jsou počet lipidů na jednotku plochy, molekulová hmotnost hydrofobních řetězců a hustota hydrofobní zóny. Vzhledem ke „kolísání tloušťky“ hydrofobních oblastí by hc mělo být rovno hav, přičemž v tomto případě by obě měly být menší než hr o tloušťku polární vrstvy (htp): hc ≅ hav = hr-htp. Pokud by lipidová dvojvrstva měla rovnoměrnou tloušťku, pak by se hc mělo rovnat hav. V případě BLM tvořené binární směsí lipidů dochází po objevení fosfolipidových domén k selektivní asociaci mezi fosfolipidy. Jejich tloušťka závisí na délce uhlovodíkového řetězce lipidových složek . Popescu et al. (1991) prokázali vznik stochastických pórů v BLM v důsledku fluktuací tloušťky dvojvrstvy. Výška energetické bariéry pro perforaci membrány v důsledku takového mechanismu je však velká (přibližně 91 kT, kde k a T jsou Boltzmannova konstanta, resp. absolutní teplota). V tomto případě má geometrický profil póru eliptický toroidální tvar. Bylo také prokázáno, že takový transmebranový pór se může vyvinout do stabilního stavu . Výsledky získané tímto modelem byly dosti překvapivé vzhledem k rychlé časové škále uzavírání statistických pórů v membránách. O dva roky později vytvořili Zhelev a Needham (1993) velké, kvazistabilní póry v lipidových dvouvrstvých vezikulách, čímž dodrželi předpověď předchozího modelu . Odolnost membrány proti prasknutí ve smyslu lineárního napětí pro velký pór v dvouvrstvých vezikulech vypočítali Moroz a Nelson (1997) .
Stochastické transmembránové póry mohou vznikat také zkresleným tepelným pohybem lipidů . Tento mechanismus se někdy nazývá termoporace. Póry vznikají v membráně prostřednictvím tepelně indukovaného aktivačního procesu. Alternativně může být aktivační proces pro tvorbu pórů vyvolán vnějším elektrickým polem (nazývaným také elektroporace) . Póry vzniklé elektroporací jsou větší a stabilnější . Mechanismus elektroporace byl navržen pro doručování léčiv a genů do buněk a tkání .
Transmembránové proteinové póry jsou tvořeny bílkovinnými systémy pokrývajícími širokou škálu od malých peptidových kanálů (např. gramicidin, alamethicin, melittin atd.) až po velké proteinové multimerní sestavené kanály. Jelikož jsou tyto póry velké a naplněné vodou, mohou přes ně difundovat hydrofilní látky, včetně iontů, a tím rozptylovat elektrický potenciál membrány. Transmembránové proteinové póry jsou tvořeny integrálními proteiny ze dvou hlavních strukturních tříd: (1) selektivní kanály tvořené svazkovými transmembránovými a-helikálními strukturami a (2) selektivní kanály, póry a poriny tvořené monomerními (např. OmpG), dimerními (např. selektivní Cl- kanály), trimerními (např. OmpF) nebo multimerními transmembránovými ß-barrel strukturami (např. α-hemolyzin, leukocidiny, cytolyziny) . Lipidovou dvojvrstvu lze použít jako systém in vitro pro studium těchto proteinových kanálů, pokud jsou rekonstituovány do funkční membrány . Kromě toho lze BLM použít jako nástroj pro membránové proteinové inženýrství a jeho aplikace buď v oblasti biomolekulární biofyziky, nebo v biotechnologické oblasti .
V jiném příkladu kolicin Ia, protein vylučovaný bakterií Escherichia coli, vytváří napětím řízené iontové kanály jak ve vnitřní membráně cílových bakterií, tak v planárních BLM . Kolicin Ia je membránový transportér patřící do třídy bakteriálních toxinů, které mají stejnou strategii: vkládají se do membrány jiné živné konkurenční bakterie, čímž vytvářejí póry velkých rozměrů. V souladu s tím tyto póry poškodí elektrochemický potenciál membrány a nakonec vyvolají smrt těchto konkurenčních bakterií. Ve srovnání s výše uvedenými stochastickými póry mají proteinové póry jiný mechanismus vzniku a také jiné vlastnosti. Zatímco stochastický pór „zapomíná“ mechanismus svého vzniku, zdá se, že některé z transmembránových proteinových pórů (např. kolicin Ia) vykazují „paměťové“ účinky, přinejmenším pod vlivem specifické sekvence pulzů používaných pro elektrickou stimulaci BLM .
Genetické póry byly nalezeny ve stěně sinusoidálních cév ze savčích jater. Endotelové buňky těchto cév mají četné póry v podobě sítkových destiček . Tyto póry o průměru asi 0,1 μm umožňují průchod části krevní plazmy a chylomikronů ze sinusoidálního prostoru do prostoru Disse. Endoteliální póry tedy řídí výměnu tekutin, rozpuštěných látek a částic mezi sinusoidální krví a prostorem Disse .
V této práci jsme použili teorii pružnosti spojitých médií k popisu výskytu stochastických pórů přes planární BLM.
.