Hlavní kapsidový protein P74-26 využívá jedinečné architektonické prvky -lassos, prstence a chlopně – ke zvýšení stability kapsidy. Pozorujeme zvýšené hydrofobní interakce na rozhraní podjednotka-podjednotka v kapsidě. Odhaduje se, že hydrofobní interakce jsou u P74-26 >2krát vyšší než u ostatních mezofilních homologů (doplňkové tabulky 3 a 4). Toto pozorování může částečně vysvětlovat zvýšenou termostabilitu kapsidy P74-26, protože hydrofobní efekt nabývá na síle při vysoké teplotě32. Naproti tomu jsme nepozorovali žádnou významnou změnu v počtu vodíkových vazeb nebo solných můstků (doplňkové tabulky 3 a 4), což jsou další interakce, které podle pozorování propůjčují termostabilitu některým globulárním proteinům33,34,35,36.
Zjištění zvýšeného počtu hydrofobních interakcí u kapsidy P74-26 nás nijak zvlášť nepřekvapilo. Četné studie termofilních globulárních proteinů ukazují zvýšené hydrofobní síly jako hlavní faktor přispívající k tepelné stabilitě33,37,38,39,40 . Existují však dvě věci, které z kapsidy P74-26 činí jedinečný modelový systém: (1) vysoký vnitřní tlak těsně zabalené DNA vyvolává v kapsidě mechanické napětí7,8,27 a (2) jedná se o samosestavující se strukturu, v níž architektura a topologie mezi podjednotkami hraje důležitou roli v celkové stabilitě. Tyto principy můžeme odvodit porovnáním struktury P74-26 se strukturou četných mezofilních homologů.
Zjistili jsme, že kapsida P74-26 je stabilizována několika smyčkami a prodlouženími, které tvoří topologické vazby mezi podjednotkami. Unikátní laso ve smyčce E se připojuje ke smyčce G a doméně P sousedního MCP, které fungují jako závěs pro topologické uvázání lasa. Kromě toho N- a C-ramena spolu s Dec-ramenem zcela obepínají β-řetězce smyčky E, což je další architektonický prvek jedinečný pro P74-26 (obr. 5e). Smyčka E je tedy kroužkovaná směrem k bázi a laso směrem ke špičce.
Druhé laso je tvořeno ramenem N, které vytváří jak intrakapsomerní, tak interkapsomerní interakce. N-rameno se váže na E-smyčku sousedního MCP uvnitř kapsomeru prostřednictvím vlákna horního ramene, šroubovice předloktí a oblasti ruky (obr. 5a, c). Kromě toho loket, předloktí a ruka stabilizují interakce kapsomer-kapsomer vazbou s DecP74-26 a podjednotkou MCP, která leží napříč dvojnásobnými/kvazi dvojnásobnými osami (obr. 6a, b). Ačkoli N-rameno není technicky vzato uzavřenou smyčkou, P74-26 ji účinně uzavírá pomocí jedinečné S-smyčky, která fixuje polohu oblastí předloktí a ruky (obr. 6c). U mezofilních Caudovirů31,41,42,43,44,45,46 jsme podobnou architekturu lasa na N-rameni nenašli, což naznačuje, že tato architektura je důležitá pro zvýšení stability kapsidy.
Ačkoli se lasa u jiných Caudovirů nevyskytují, vzdáleně příbuzné herpesviry obsahují analogickou architekturu lasa na N-rameni záhybu HK9747,48,49 . Podobně jako N-rameno P74-26 nejsou lasa v N-rameni herpesvirů skutečnými uzavřenými smyčkami. Navzdory této zdánlivé podobnosti fungují lassos herpesvirů odlišně. Stabilizují výhradně interkapsomerní interakce, zatímco laso N-ramene P74-26 stabilizuje jak intrakapsomerní, tak interkapsomerní interakce. Pentony herpesvirových kapsid navíc nevykazují lasso interakce a interakce jsou variabilní v rámci hexonových podjednotek, zatímco P74-26 má téměř identické lasso interakce v rámci pentonů i hexonů. Tato pozorování naznačují, že lasso architektura se pravděpodobně vyvinula nezávisle, a zdůrazňují flexibilitu topologických stabilizačních mechanismů. Předpokládáme, že architektura roztažitelných ramen usnadňuje evoluci silnějších interakcí v rámci samoskladných systémů, jako jsou kapsidy. Tyto smyčky s otevřeným koncem lze snadno posílit sériovým prodloužením o jeden zbytek. Možná právě tato snadná evoluce je důvodem, proč se prodloužená ramena lassy vyskytují jak u P74-26, tak u herpesvirů. Tato prodloužená lassos jsou podobná N- a C-koncovým prodloužením, která zprostředkovávají sestavení u jiných virů (tj. C-koncová prodloužení u plášťových proteinů kapsidy SV4050). Předpokládáme, že tyto typy prodloužených lassos mohou být užitečné pro inženýrství stabilnějších kapsid a jiných samosestavujících se částic.
Další výhodou architektury lasso je, že může zaujmout méně prodlouženou konformaci. P74-26 MCP má dvě lasa na obou koncích záhybu HK97, přičemž obě jsou pravděpodobně přítomna v mnohem menším prokapsidu. Pomocí těchto laso struktur si může P74-26 zachovat vysokou stabilitu a zároveň poskytnout konformační flexibilitu pro rozšíření během zrání. Předpokládáme, že lasa jsou v prokapsidu méně prodloužená; při expanzi kapsidy dosáhnou lasa svého plného prodloužení, kde se uzamknou. Plné prodloužení pozorované u zralého kapsidu by zajišťovalo tahovou integritu, jak uvádíme níže.
P74-26 používá propletené chlopně k topologické stabilizaci kontaktů mezi kapsomery. Smyčka T stabilizuje interkapsomerní interakce tím, že se zasune do drážky na P-doméně podjednotky MCP v sousedním kapsomeru. Tyto interakce smyčky T se nacházejí podél trojnásobných/čtyřnásobných os podél vnitřní strany kapsidy (obr. 7b; doplňkový obr. 7b). Podobně jsou mezikapsomerní dvojnásobné/kvazi-dvojnásobné interakce stabilizovány na vnější straně kapsidy prokládaným uspořádáním N-ramen (obr. 7c; doplňkový obr. 7a). Tyto překrývající se struktury připomínají prokládané uspořádání chlopní v horní části pohyblivé krabice. Tímto způsobem jsou vnější a vnitřní strana kapsidy stabilizovány dvěma samostatnými prolínajícími se interakcemi chlopní. Navrhujeme, aby uspořádání pohyblivé krabičky pozorované na osách symetrie a kvazisymetrie výrazně posilovalo kapsidu proti vnitřnímu tlaku, protože je topologicky náročné je narušit. Tato uspořádání jsou však pravděpodobně také náročná na sestavení, což vyvolává důležitou otázku, jak se kapsida P74-26 sestavuje s prokládanou architekturou.
Ozdobný protein P74-26 podobně přijímá jedinečné strukturní uspořádání, které významně přispívá k termostabilitě kapsidy. Dekorační proteiny zvyšují stabilitu kapsidy28,29,51, ačkoli byly postulovány i další role52. Trojnásobné/čtyřnásobné osy jsou stabilizovány trimerem DecP74-26. Ve srovnání s mezofilními Caudoviry interaguje trimer DecP74-26 s více podjednotkami na mnohem větší interakční ploše (obr. 8a). Celková interakční plocha na jednu podjednotku DecP74-26 je poměrně pozoruhodná: Pro protein o 146 reziduích je tato hodnota velmi vysoká: ~4100;Å2. Naše předchozí studie ukázala, že DecP74-26 je podstatně stabilnější než jeho mezofilní homology, a tato stabilizace je dána především tvorbou mimořádně těsného trimeru23. Trimerizační interakce však tvoří pouze malou část celkové interakční plochy DecP74-26 (~18 % celkové interakční plochy na podjednotku DecP74-26). To naznačuje, že interakce DecP74-26 s kapsidou přispívají podstatnou měrou ke stabilitě.
Interakce mezi trimery DecP74-26 tvoří klec držící kapsidu pohromadě (obr. 8b). Toto uspořádání je pro P74-26 jedinečné. Například fágy lambda a TW1 používají velmi podobné složení dekoračního proteinu23 , ale interakce jejich Dec-ramena s ostatními kapsidovými proteiny je mnohem omezenější29,44 . Navíc nepříbuzný dekorační protein fága L se nespojuje se sousedními trimery a ve skutečnosti chybí v osách kvazi-trimerů52. Fág T4 je zdoben proteinem Soc, který interaguje se sousedními podjednotkami Soc na trojnásobných a kvazitrojnásobných osách; Soc je však přítomen v relativně nízkém obsazení (~50 %), takže klec je neúplná41. Protože dekorační proteiny v prokapsidě obvykle chybí29, očekáváme, že klec DecP74-26 se při expanzi kapsidy sestaví kooperativně, aby stabilizovala kapsidu. Budoucí experimenty budou zkoumat roli kooperativity při sestavování a stabilitě.
Architektonická vylepšení v P74-26 MCP a Dec zajišťují stabilizaci proti vysokému vnitřnímu tlaku. Jak působí síly vnitřního tlaku na kapsidu a jak architektura kapsidy těmto tlakům odolává? Pokud předpokládáme, že tlak od zapouzdřené DNA je rovnoměrně rozložen kolem izometrického kapsidu, pak na všechny body kapsidu působí vektor síly, který je kolmý k povrchu kapsidu. Analogicky působí na kapsidu síly, které jsou podobné silám působícím na balón. Vnitřní tlak tedy způsobuje boční napětí na interakce kapsidy. I když vysoký vnitřní tlak, který fág vykazuje, zpochybňuje stabilitu kapsidy, může umožňovat mechanismy stability, které se spoléhají na tensegritu. Je možné, že vnitřní tlak lze využít k vytvoření částice stabilizované napětím na jednotlivých podjednotkách. Na podporu tohoto tvrzení lze uvést, že kapsidy pikornavirů, které se potýkají s podstatně menším vnitřním tlakem, mohou být stabilizovány drobnými modifikacemi kapsidy53.
Architektura kapsidy P74-26 je konstruována tak, aby odolávala bočnímu napětí prostřednictvím tenzní integrity. Tenzní integrita neboli tensegrita je zobecněný mechanismus pro stabilitu architektury, který zahrnuje strukturované oblasti držené pohromadě sítí pružných prvků, které jsou pod neustálým napětím54. V kapsidě P74-26 jsou strukturovanými oblastmi domény A a P a pružnými prvky, které přenášejí napětí, jsou lassos a prodloužená ramena. Například laso smyčky E se napne proti závěsnému sloupku tvořenému smyčkou G a P-doménou souseda. Podobně rameno N tvoří laso, jehož konec drží na místě smyčka S, která se uzamkne v drážce mezi předloktím a rukou (obr. 6c). Předpokládáme tedy, že smyčka S bude vykazovat znaky záchytné vazby, nekovalentní vazby, která se pod napětím stává pevnější55. Kapsida P74-26 navíc obsahuje několik chlopní, které se navzájem proplétají. Tyto interakce by topologicky odolávaly příčnému a podélnému napětí vnitřního tlaku. Jako celek tyto prvky lasa a chlopně využívají tahu, aby odolaly strukturálnímu selhání kapsidy. Zde pozorovaný mechanismus tensegrity je jednoduše propracovanějším příkladem tensegrity kapsidy, který před mnoha lety navrhl Caspar56.
Interakce lasa, chlopní a ramen jsou umístěny tak, že vnitřní tlak rozkládá napětí na více vazeb. Například na β-smyčku E působí síly podél osy listu. Proto jsou namáhány všechny vazby, které drží list pohromadě, spíše než ortogonální geometrie, ve které je napětí pouze na vazbách na konci listu. Selhání kapsidy by vyžadovalo současné přerušení mnoha vazeb (střižná geometrie) spíše než rozpojovací geometrie, při níž se vazby trhají jedna po druhé57. Průkopnické studie jednotlivých molekul ukázaly, že střižná geometrie vyžaduje k narušení mnohem větší síly, než když síly působí v rozpojovací geometrii58,59,60. Kapsida P74-26 je tedy konstruována tak, že boční síly působí ve střižné geometrii, což vede k vysoké tensegritě.
Kromě jedinečné stabilizační architektury kapsidy P74-26 využívá také nekanonický mechanismus změny kapacity kapsidy. Kapsida P74-26 je větší než u většiny kaudovirů, což koreluje s jeho abnormálně velkým genomem. Většina Caudovirů T = 7 má velikost genomu mezi 30 a 50 kb (doplňková tabulka 2), zatímco genom fága P74-26 je téměř dvakrát tak dlouhý – 83 kb24. Na základě velikosti genomu jsme předpokládali, že kapsida bude mít T = 12 (průměrná velikost genomu ~80 kb61), i když by bylo možné použít i T = 9 nebo T = 13 (průměrná velikost genomu ~70, resp. ~120 kb). Kapsida P74-26 dosahuje této větší velikosti spíše výrazným zvětšením velikosti kapsomerů než změnou ikosaedrické složitosti. Kapsomer je větší, protože MCP P74-26 pokrývá větší plochu než obvykle, a to navzdory typické délce pro MCP. V důsledku toho je kapsomer o něco tenčí než normálně (obr. 4b). Počet zbytků v MCP tedy nepředpovídá celkovou pokrytou plochu a velikost genomu nepředpovídá počet triangulací.
Nedávno Bayfield a spol.62 určili strukturu blízce příbuzného termofilního fága T = 7, který podobně používá zvětšené kapsomery ke zvýšení kapacity kapsidy. Podle našich znalostí se jedná o nekanonický mechanismus zvyšování kapsidové kapacity. Existují dva klasické mechanismy zvětšení kapsidy: (1) zvýšením počtu triangulací a (2) přeměnou izometrické hlavy na prolongační. V prvním případě se hexony přidávají přes všechny stěny kapsidy, zatímco ve druhém případě se hexony přidávají přes deset ikosaedrických stěn tak, že se kapsida prodlouží v jednom rozměru (obr. 9). V obou případech zůstávají kapsomery stejně velké. Zde jsme identifikovali třetí mechanismus evoluce větší kapsidy: zvětšení velikosti kapsomeru.
Mechanismy zvětšení kapacity kapsidy. P74-26 využívá nový mechanismus pro zvýšení kapsidové kapacity zvětšením velikosti kapsomerů při zachování geometrie T = 7
Tyto tři mechanismy mají velmi odlišné evoluční bariéry. Dva klasické mechanismy lze realizovat pomocí jednoduchých mutací a byly mnohokrát pozorovány. U mnoha virů modifikují jednoduché bodové mutace triangulační číslo5,63,64. Kromě toho lze triangulační číslo některých kapsid změnit, aniž by se změnila sekvence MCP3,65,66. Podobně jednoduché bodové mutace u fága T4 přeměňují kapsidu z prolátní na izometrickou nebo vytvářejí obří hlavy, u nichž je prodloužena dlouhá osa prolátní hlavy4,67. Zdá se tedy, že evoluční bariéry pro změnu objemu kapsidy prostřednictvím těchto dvou klasických mechanismů jsou poměrně nízké. Naproti tomu zde identifikovaná strategie zvětšeného kapsomeru vyžaduje mnohonásobné, rozsáhlé změny v sekvencích kapsidových proteinů. Větší kapsida P74-26 vyžaduje rozsáhlé změny osmi samostatných modifikací struktury MCP a také ramene Dec (obr. 3a, b a 4c, d). Nabízí se otázka: proč fág P74-26 využil tuto zdánlivě náročnější evoluční strategii namísto jednodušších, klasických strategií? Jaká omezení bránila evoluci větší kapsidy klasickými cestami?
Naší první hypotézou je, že lassos, klapky a ramena stabilizující kapsidu P74-26 vyžadují pro svou funkci větší kapsomer. Je možné, že lassos potřebují další prostor, aby se otevřely natolik, aby se do nich mohla vložit struktura závěsného sloupku. Stejně tak mohou chlopně a ramena vyžadovat určitou délku, aby vyvolaly svou stabilizační aktivitu. Pokud by tomu tak bylo, pak architektonické prvky stabilizující kapsidu vyžadují větší kapsomery než obvykle. V tomto scénáři je větší kapsomer vybraným strukturním prvkem a geometrie T = 7 je spandrel: biologická struktura, která je spíše vedlejším produktem evoluce než výsledkem přímého výběru68. Této hypotéze se však nepřikláníme, protože lassos se vyskytuje u herpesvirů, u nichž je typická velikost záhybu HK97 (MCP herpesvirů mají několik dalších věžových domén, které zvětšují velikost, ale tyto domény nejsou součástí hlavního patra kapsidu a nepřispívají k záhybu HK9749). Kromě toho jiné Caudovirus MCPs obsahují dlouhá N-ramena (např. fág Sf631) nebo smyčky E, které jsou otevřené téměř stejně široce jako P74-26 (např. fág P2243), ale tyto proteiny mají typickou velikost. Nicméně tato hypotéza zůstává neověřená.
Druhou hypotézou je, že velikost genomu a kapacita kapsidy se vyvinuly společně díky malému souběžnému zvětšení. Pokud se u předků fágů vyvinul o něco větší genom, než se vejde do kapsidy, pak může existovat selekční tlak na mírně větší kapsidu. Zvyšování počtu T nebo přechod na prolátovanou hlavu podstatně zvětšuje objem kapsidy, což vede k velkému poklesu vnitřního tlaku. Od těchto přechodů lze odrazovat, protože pro infekci je třeba udržet vnitřní tlak26. Aby se zabránilo velkým změnám vnitřního tlaku, mohou větší kapsomery pomalu koevulovat s větším genomem.
Naší poslední hypotézou je, že geometrie kapsidy má přímý vliv na celkovou stabilitu kapsidy. Předpokládáme, že geometrie T = 7 je ze své podstaty stabilnější než geometrie s vyšším počtem triangulací v důsledku variabilních konformací hexonů. Všechny kapsidy, které mají T = 9 nebo vyšší, mají přítomno více než jeden typ hexonu, zatímco všechny kapsidy T ≤ 7 mají přesně jeden typ hexonu (s výjimkou T = 1, která nemá žádné hexony69,70). Například T = 7 má konformaci hexonu s jedním křídlem, zatímco T = 9 má jak křídlaté, tak ploché hexony (doplňkový obr. 11a, b). Všimli jsme si také, že prolité kapsidy mají více typů hexonů (obecně tři nebo více hexonových konformací; obr. 9). Hlavní kapsidové proteiny ve virech T > 7 se tedy musí přizpůsobit hexonové konformační heterogenitě, což může nepříznivě ovlivnit stabilitu.
Předpokládáme, že geometrie T = 7 je nejvyšší složitost (tj. největší velikost), která je přirozeně stabilní. Složitější geometrie by vnášely nestabilitu prostřednictvím variability konformace hexonu. Tato inherentní nestabilita může vyžadovat další stabilizační mechanismy, které by ji zmírnily, například dekorační proteiny, které by strukturu upevnily. Předpokládáme, že geometrie T > 7 má dvě vzájemně se nevylučující nevýhody. Za prvé, každá z oddělených konformací hexonu musí zůstat funkční a stabilní, což by omezovalo evoluci proteinů MCP za účelem větší stability. Druhou výhodou je, že nižší počet triangulací vede k menšímu počtu rozhraní mezi podjednotkami, čímž se minimalizuje počet slabých míst v kapsidě. Na podporu této hypotézy uvádíme příklad extremofilního archeálního viru HSTV-2 (Halorubrum sodomense taled virus 2), který svůj genom o velikosti ~68 kb balí do hlavičky T = 771 . HSTV-2 využívá větší kapsidu, než je obvyklé, a má také trimerní ozdobné proteiny, které se nacházejí na trojnásobné/čtyřnásobné ose. Skutečnost, že tento mechanismus zvětšení kapsidy byl pozorován pouze u extrémofilů, podporuje myšlenku, že geometrie T = 7 má příznivý vliv na stabilitu. Další podporou naší hypotézy je skutečnost, že všechny známé T > 7 kapsidy používají (pokud je nám známo) zdobící proteiny, zatímco mnoho virů s T = 7 zdobící proteiny postrádá.
Pokud mají různá trojúhelníková čísla různou vnitřní stabilitu, naznačovalo by to, že každá geometrie vykazuje slabá místa v různých oblastech kapsidy, jak bylo předpovězeno na základě teoretických prací72. Předpokládáme, že trojnásobné/čtyřnásobné osy představují slabé body v mřížce s T = 7. Na podporu této hypotézy se dekorační proteiny T = 7 kaudovirů běžně nacházejí na trojnásobných/čtyřnásobných osách (doplňková tabulka 2)29,44,52. Tyto osy jsou navíc stabilizovány kovalentními příčnými vazbami u fága HK9745 a chlopněmi smyčky T u P74-26 (obr. 7b). K dalšímu prozkoumání této myšlenky uvádíme, že fág T = 9 také používá dekorační proteiny na trojnásobných osách73,74, zatímco fágy T = 12 a T = 13 používají dekorační proteiny v centrech kapsomerů61,75,76.
Poznamenáváme, že všechny naše analýzy byly primárně zaměřeny na Caudoviry. Tyto viry obvykle nerozkládají své kapsidy v rámci svého životního cyklu, takže kapsida nemá selekční tlak na labilitu. Ve skutečnosti vysoký tlak zabalené DNA představuje vysoký selekční tlak na vývoj stabilních kapsid. Je pravděpodobné, že jiné typy virů používají jiné mechanismy stability, zejména viry, které své kapsidy rozkládají jako nezbytnou součást svého životního cyklu
.