Free Press

Úvod

Pro zajištění dostatečných potravin a výživy světové populace, která by měla do roku 2050 dosáhnout 9 miliard (http://www.unpopulation.org), je třeba zvýšit výnosy rýže nejméně o 60 % (FAO 2009). Rýže je základní potravinou více než poloviny světové populace a tato populace konzumující rýži roste tempem 1,098 % ročně (http://esa.un.org/wpp/Excel-Data/population.htm). Stoupající počet obyvatel znamená větší poptávku po potravinách, vodě a půdě v době, kdy dochází k degradaci přírodních zdrojů pro zemědělství, protože velké plochy zemědělské půdy jsou odkloněny od produkce potravin k industrializaci a výrobě biopaliv. Nepředvídatelná změna klimatu hrozí dalším úbytkem zemědělsky využitelné půdy v důsledku častějších případů sucha a záplav (http://www.fao.org/docrep/017/aq191e/aq191e.pdf). Vzhledem k tomu, že rostoucí populace a globální změna klimatu zvyšují tlak na světové zásobování potravinami, je nezbytné nadále zlepšovat výkonnost plodin z hlediska produktivity obilovin, abychom udrželi krok s růstem populace. Zvýšení produktivity plodin, které přinesly typy rostlin vytvořené v období zelené revoluce, podpořilo populační boom po dvou světových válkách. Od té doby se navzdory používání zdokonalených odrůd a pokročilých technologií výnosový potenciál současných odrůd rýže zlepšil jen nepatrně, což naznačuje, že tyto odrůdy narazily na výnosový strop (Akita 1994). V poslední době probíhá pokus o zvýšení výnosového potenciálu rýže pomocí inženýrství účinné fotosyntézy typu C4 v rýži (Kajala et al. 2011). K tomu je třeba do rýže vložit soubor genů, které regulují anatomii listů a biochemické procesy, a vhodným způsobem je exprimovat, což v současné době není možné pouze pomocí konvenčních technik šlechtění rostlin. Proto by genetické inženýrství pro zlepšení fotosyntetické dráhy rýže poskytlo dostatečnou příležitost ke zvýšení skutečné produktivity zrna i výnosového potenciálu. Genové inženýrství poskytuje účinný a přesný šlechtitelský nástroj, do kterého lze vnést pouze geny, které jsou předmětem zájmu, a to i ze vzdáleně příbuzných druhů.

V C3 rostlinách, jako je rýže, je CO2 asimilován na tříuhlíkatou sloučeninu fotosyntetickým enzymem ribulosa-1, 5-bisfosfátkarboxylázou oxygenázou (Rubisco). Jak název napovídá, Rubisco také katalyzuje oxidaci ribulosa-1, 5-bisfosfátu (RuBP) v neekonomickém procesu známém jako fotorespirace, který může způsobit ztrátu až 25 % dříve fixovaného uhlíku (Sage 2004). Při teplotě nad 30 °C, která je typická pro tropické oblasti pěstování rýže ve světě, se výrazně zvyšuje rychlost oxygenace, což výrazně snižuje účinnost fotosyntézy C3 rostlin až o 40 % (Ehleringer a Monson 1993). Fotosyntéza rýže v tropech a teplých oblastech mírného pásma se tak stává neúčinnou. Rostliny C4, které mají v listech mechanismus koncentrace CO2, mají velmi sníženou úroveň fotorespirace, a proto se vyvinuly tak, aby se jim dařilo v horkém a suchém prostředí, a nabízejí cenné poznatky pro strategie zlepšování plodin. Rýže s mechanismem fotosyntézy C4 by měla vyšší účinnost fotosyntézy a zároveň by efektivněji využívala omezené zdroje, jako je půda, voda a hnojiva, konkrétně dusík (Hibberd et al. 2008). Protože rýže s mechanismem C4 bude dobře fungovat při vysokých teplotách a bude potřebovat méně vody a dusíku, přinesla by výhody různým typům rýžových ekosystémů, včetně marginálních půd.

Fotosyntéza typu C4 je jedním ze tří typů biochemických mechanismů, které rostliny využívají k fixaci atmosférického CO2, dalšími jsou C3 a metabolismus krassulových kyselin (CAM). Fotosyntéza typu C4 se vyvinula více než 66krát nezávisle na sobě (Sage et al. 2012) nejméně u 19 čeledí během evoluce nahosemenných rostlin z C3 předků (Muhaidat et al. 2007) a zahrnuje alternace buněčných struktur, biochemie, a tedy i vývoje listů. Tato vysoce specializovaná forma fotosyntézy má v podstatě vyvinutý mechanismus koncentrace CO2 kolem enzymu Rubisco, čímž se eliminuje oxygenázová funkce Rubisco, a tím se snižuje plýtvání energií v důsledku fotorespirace (Douce a Heldt 2000). Rubisco z druhů C4 je z hlediska karboxylace účinnější než z druhů C3 (Kubien et al. 2008). Mezi další přidružené výhody systému C4 patří vyšší účinnost využití vody, protože strmější koncentrační gradient pro difúzi CO2 může být udržován přes částečně uzavřená stomata, vyšší účinnost využití záření, protože účinnost fotosyntézy C4 se nenasytí při vysoké intenzitě světla (Rizal et al. 2012), a vyšší účinnost využití dusíku, protože bude vyžadovat méně Rubisco, a tedy méně dusíku.

Rostliny C4 jsou potenciálně produktivnější při vyšších teplotách, které jsou typické pro rýži. Aby bylo možné využít výhod tohoto účinnějšího fotosyntetického systému v době, kdy počet obyvatel a ceny potravin prudce rostou, existují snahy o vložení mechanismu C4, který se vyskytuje například u kukuřice, do rýže (Rizal et al. 2012). Tento nový přístup k modifikaci systému fotosyntézy rýže je náročným a dlouhodobým úsilím, protože dráha C4 je velmi složitá a mnoho faktorů, které tento mechanismus řídí, je stále neznámých. Proto vyžaduje vynalézavost a odborné znalosti vědců zabývajících se různými obory, jako je genové inženýrství, biochemie, bioinformatika, molekulární biologie, fotosyntéza, systémová biologie, fyziologie, šlechtění rostlin, metabolomika atd. Za tímto účelem bylo koncipováno a založeno konsorcium pro rýži C4, které od roku 2009 zahájilo praktickou činnost v oblasti inženýrství rýže C4 (http://photosynthome.irri.org/C4rice/). Tento přehled přináší aktuální informace o požadavcích na vývoj rýže C4 a o pokroku dosaženém v oblasti genového inženýrství. Na základě studia evoluce C4 z C3 druhů a souvisejících změn jsou pro vytvoření funkční fotosyntetické dráhy C4 u rýže nezbytné následující úpravy.

Zvýšit počet a velikost chloroplastů v buňkách svazkových pochev rýže

V rýži se více než 90 % všech chloroplastů nachází v mezofylových buňkách (MC) uvnitř listu (Yoshimura et al. 2004); zatímco u rostlin C4 mají MC i buňky svazkových pochev (BSC) stejný počet chloroplastů (obr. 1A a B). Je to proto, že u rostlin C3 probíhá celý proces fotosyntézy v MC, ale u rostlin C4 je proces fotosyntézy kompartmentalizován do MC a BSC. MC provádějí první fixaci CO2, při níž vzniká čtyřuhlíkatá sloučenina zvaná oxaloacetát, která se přeměňuje na kyseliny C4, jako je malát, které se transportují do BSC, čímž umožňují účinnou asimilaci CO2 na sacharidy pomocí Calvinova cyklu v BSC. Na rozdíl od C3 rostlin mají tedy BSC C4 rostlin fotosyntetické funkce, jako je dekarboxylace C4 sloučeniny a proces Calvinova cyklu. K provádění těchto procesů jsou BSC u rostlin C4 zvětšeny a mají více chloroplastů, čímž jsou BSC výraznější a fotosynteticky aktivnější. Funkcí BSC u C3 druhů je vyrovnávat hydraulický tlak, zabraňovat pronikání vzduchu z mezibuněčných prostor do xylému, poskytovat zásobárnu vody pro vyrovnávání ztrát způsobených transpirací, umožňovat vstup a rozptyl vyšší intenzity světla, které dopadá na žilky, do listu (Nikolopoulos et al. 2002). Mezi další funkce BSC C3 rostlin patří transport dusíku, síry, sacharidů a role v signální dráze, která byla obsáhle popsána v (Leegood 2008). U druhů C4 spolupracují BSC a MC ve dvoustupňové verzi fotosyntézy. Aby byl zajištěn přímý kontakt mezi BSC a MC, mají rostliny C4 zvláštní druh anatomie listů doprovázený proliferací chloroplastů v BSC. K zavedení cesty C4 do rýže je zapotřebí více fotosyntetických chloroplastů v BSC, než má rýže nyní. Toho lze dosáhnout nadměrnou expresí genetických prvků, které jsou nezbytné pro vývoj chloroplastů, jako jsou geny podobné Golden2 (GLK), buněčně specifickým způsobem pomocí promotorů genů C4, jako je promotor fosfoenolpyruvátkarboxylázy (PEPC) Zea mays pro expresi specifickou pro MC a promotor fosfoenolpyruvátkarboxykinázy (PCK) Zoysia japonica pro expresi specifickou pro BSC v listech rýže (Matsuoka et al. 1994; Nomura et al. 2005).

Členové rodiny genů GLK (Golden2-like) kódují jaderné transkripční faktory, které se podílejí na regulaci vývoje chloroplastů u Arabidopsis, Zea mays a mechu Physcomitrella patens (Rossini et al. 2001). U každého z těchto druhů existují geny GLK jako homologní pár pojmenovaný jako GLK1 a GLK2 (Waters et al. 2009). U mechu a Arabidopsis jsou geny GLK redundantní a funkčně ekvivalentní, zatímco u kukuřice a čiroku působí geny GLK specifickým způsobem podle buněčného typu a řídí vývoj dimorfních chloroplastů (Waters et al. 2008; Wang et al. 2013a). U kukuřice se transkripty genu Golden2 (G2) a jeho homologu ZmGLK1 hromadí především v buňkách BS, respektive M, což naznačuje specifickou roli každého genu regulujícího diferenciaci dimorfních chloroplastů (Wang et al. 2013a).

Zmenšit rozestup žilek, a tím zvýšit hustotu žilek v listu

U C3 druhů probíhá fotosyntéza v MC. Vysoký počet MC mezi po sobě jdoucími žilkami (obr. 1A) odsouvá žilky daleko od sebe, čímž se zvětšuje rozestup žilek nebo snižuje jejich hustota. V listech rýže je méně než 6 žilek na mm (obrázek 2A), Setaria viridis a čirok (oba jsou typické C4 druhy) mají více než 7 žilek na mm (obrázek 2B a C). Listy C4 mají v průměru 2 MC mezi žilkami (obrázek 1B). Vyšší hustota žilnatiny v listech rostlin C4 vede k poměru objemů M a BS pletiv téměř jedna ku jedné. Vnitřní anatomie listu C4 je často tvořena opakujícím se vzorem žíla-BS-M-M-BS-žilka. BSC obklopené MC tvoří věncovitou strukturu; tento typ anatomie listů označil německý botanik G. Haberlandt jako „Kranzovu anatomii“. BSC C4 mají hustou cytoplazmu a jsou vyplněny velkým počtem chloroplastů (obr. 1B). Pro účinné fungování C4 dráhy je nezbytný těsný kontakt mezi M a BS buňkami, které jsou navzájem těsně propojeny velkým počtem plazmodesmat Dengler a (Nelson 1999). Kranzova anatomie se s malými odchylkami vyskytuje téměř u všech monokotyledonních a dikotyledonních linií, které využívají dvoubuněčný způsob fotosyntetické dráhy C4. Studie anatomie a morfologie listů odhalily několik genů zodpovědných za růst, vývoj nebo deformace buněk v listech. Gen ACAULIS1 byl zodpovědný za prodlužování listových buněk (Tsukaya et al. 1993). Mutace v genu CURLEY LEAF (CLF) vedla u Arabidopsis ke vzniku stočených listů (Kim et al. 1998). Zvýšení volného zakončení žilek, otevřený vzor žilnatiny a zaoblená struktura listů byly způsobeny genem rotunda 1 (RON1) (Robles et al. 2010). Mutace v genu Scarecrow u kukuřice vykazovala zvýšení počtu BSC, neobvyklou diferenciaci chloroplastu BS, snížení počtu drobných žilek a změnu hustoty žilnatiny (Slewinski et al. 2012). Tyto studie týkající se abnormálního vzorování žilek způsobeného mutací konkrétních genů poskytují určité vodítko k tomu, jak je Kranzova anatomie regulována, a naznačují zapojení více drah do vývoje Kranzova vzoru. Bylo zjištěno, že regulační síť SCARECROW/SHORTROOT je jednou z důležitých složek potřebných pro vzorování Kranzovy anatomie, protože listy C3 rostlin s mutovaným genem Scarecrow byly normální, zatímco u C4 rostlin mutace téhož genu poškodila Kranzovu anatomii (Slewinski et al. 2012; Wang et al. 2013b). Nedávno se ukázalo, že vnesení chromozomů kukuřice do ovsa mohlo zvětšit velikost BSC a zmenšit rozestupy žilek v C3 listech ovsa, což dokazuje, že anatomii C3 listů lze modifikovat (Tolley et al. 2012). Kromě toho bylo vynaloženo velké úsilí na screening mutantů čiroku (C4) se zvětšeným rozestupem žilek a mutantů rýže (C3) se zmenšeným rozestupem žilek, aby bylo možné identifikovat geny řídící znak rozestupu žilek (Rizal et al. 2012).

Aktivita Calvinova cyklu by měla být výrazně snížena v MC a výrazně zvýšena v BSC rýže

Fotosyntéza C4 je charakterizována biochemickým mechanismem čerpání CO2, který zvyšuje koncentraci CO2 v místě Rubisco. Vysoká hladina CO2 v okolí Rubisco snižuje rychlost fotorespirace a zvyšuje čistou asimilaci CO2, což vede k vysoce účinné fotosyntéze Weber a von (Caemmerer 2010). Aby toho bylo dosaženo, je asimilace CO2 v C4 rozdělena mezi dva typy buněk, MC a BSC (obr. 3). Fixace uhlíku v C4 proto závisí na expresi a lokalizaci genů specifických pro jednotlivé buňky. Sousední fotosynteticky aktivní buňky BS a M se vzájemně ovlivňují, aby eliminovaly fixaci O2 katalyzovanou Rubiscem. U dvoubuněčných rostlin typu C4 je CO2 nejprve fixován na kyselinu C4 pojmenovanou jako oxalacetát v MC pomocí O2-nesenzitivní karboxylázy zvané fosfoenolpyruvátkarboxyláza (PEPC, EC 4.1.1.31). Oxaloacetát je poté přeměněn na malát nebo aspartát a je transportován do BSC, kde je dekarboxylován a uvolňuje se CO2. Tento CO2 je refixován Rubiscem a všechny následné činnosti Calvinova cyklu probíhají v chloroplastech BSC (Nelson a Langdale 1989). Proto, aby rýže fungovala jako C4, musí být aktivita Rubisco výrazně snížena v MC a zvýšena v BSC, což pak omezuje Calvinův cyklus na BSC rýže jako v systému C4. Na druhou stranu musí být v cytosolu MC rýže nadměrně exprimovány některé geny kódující C4 enzymy, jako je β karbonická anhydráza (CA) a PEPC, aby byla usnadněna primární fixace CO2 a CO2 mohl být koncentrován a dodáván Rubisco v BSC. Cyklus C4 zahrnuje také rozsáhlý transport metabolitů přes membránu chloroplastového obalu a plasmalemu MC a BSC (obr. 3). Kromě základních enzymů C4, tedy CA, PEPC, pyruvát ortofosfát (Pi) dikinázy (PPDK, EC 2.7.9.1), NADP-dependentní malátdehydrogenázy (NADP-MDH, EC 1.1.1.82) a NADP-dependentního jablečného enzymu (NADP-ME, EC 1.1.1.40), C4 dráha také vyžaduje vložení přenašečů metabolitů pro oxalacetát, malát, triose-fosfát a pyruvát do rýže, aby byla zajištěna zvýšená transportní kapacita pro meziprodukty C4 cyklu a Calvinův cyklus mohl v BSC účinně fungovat (Weber a von Caemmerer 2010).

Fotorespirace v mezofylových buňkách musí být značně omezena

U C3 rostlin probíhá v MC fixace uhlíku a Calvinův cyklus. Při fixaci uhlíku reaguje ribulosa- 1,5-bisfosfát (RuBP) – pětiuhlíkatá sloučenina, katalyzovaná enzymem ribulosa-1,5-bisfosfátkarboxylasa oxygenasa (Rubisco, EC.4.1.1.39) s CO2 za vzniku dvou molekul tříuhlíkaté sloučeniny zvané 3-fosfoglycerát (3-PGA). V rámci Calvinova cyklu se ze dvou molekul PGA vytvoří energeticky bohatá molekula cukru (triózafosfát) a regeneruje se RuBP pro další cyklus. Při současných koncentracích CO2 v atmosféře (cca 400 ppm) katalyzuje Rubisco také reakci mezi RuBP a O2, jejímž výsledkem je po jedné molekule 2-fosfoglykolátu a 3-PGA (Peterhansel a Maurino 2011). 2-fosfoglykolát musí být přeměněn zpět na 3-PGA procesem zvaným fotorespirace, který zahrnuje řadu biochemických reakcí. Během tohoto procesu dochází ke ztrátě dříve fixovaného uhlíku a dusíku a musí být také využita další energie (Sharpe a Offermann 2013).

C4 rostliny vyvinuly mechanismy, které omezují lokalizaci a aktivitu Rubisco v BSC. MC prostorově brání kontaktu mezi Rubisco v BSC a O2 v mezibuněčných prostorech, čímž zabraňují ztrátám energie fotorespirací. O eliminaci fotorespirace rostlinami C4 svědčí jejich velmi nízký kompenzační bod CO2, který je téměř nulový, a trvale vysoká účinnost karboxylace (CE) bez reakce na změny koncentrace O2 (obr. 4). Naproti tomu u C3 rostlin se při změně koncentrace O2 z 21 % na 2 % kompenzační bod výrazně snížil z 55 na 30 ppm (tab. 1). Na obrázku 4 byl proveden výpočet CE podle (Li et al. 2009), který ukázal, že CE čiroku se se změnou hladiny O2 významně nezměnil, ale u rýže došlo k vysoce významnému zlepšení CE při snížení hladiny O2 z 21 na 2 % (obr. 4 a tab. 1). Zvýšení CE u čiroku bylo pouze 6,1 %, zatímco u rýže 41,5 % při snížení mezibuněčné koncentrace O2 na 2 % (tabulka 1). Tyto údaje ukazují, že existuje velký potenciál pro zvýšení fotosyntetické kapacity rýže snížením fotorespirace, což by následně výrazně zvýšilo výnos. Jedním ze způsobů, jak snížit fotorespiraci v MC, je snížit obsah proteinu glycin-dekarboxylázy (GDC) v MC a omezit jeho akumulaci v BSC tak, aby k dekarboxylaci glycinu docházelo výhradně v BSC, čímž by v BSC vznikala vyšší koncentrace CO2, podobně jako v meziproduktech C3-C4 (Monson a Rawsthorne 2000). Konsorcium C4 rýže testuje tento přístup pomocí umělé mikroRNA navržené proti podjednotce GDC-H rýže, která je řízena promotorem ZmPEPC (Kajala et al. 2011). Takový biochemický mechanismus vyžaduje buněčnou specializaci BSC, která zahrnuje zvýšení počtu chloroplastů a mitochondrií obohacujících obsah organel v BSC rýže, které pomáhají při zpětném zachycování CO2 uvolněného dekarboxylací glycinu pomocí GDC (Ueno 2011). Dalším přístupem, který úspěšně zachytil CO2 uvolněný fotorespirací do místa fotosyntézy, je přenos katabolické dráhy glykolátu Escherichia coli do chloroplastů Arabidopsis thaliana, v nichž byl glykolát v chloroplastu přímo přeměněn na glycerát (Kebeish et al. 2007). Tato strategie, která snížila fotorespiraci a zvýšila fotosyntézu u Arabidopsis, zahrnovala postupnou jadernou transformaci s pěti cílenými chloroplastovými bakteriálními geny kódujícími glykolátdehydrogenázu, glyoxylátkarboligázu a tartronovou semialdehydreduktázu, by mohla být použita i u jiných C3 rostlin, jako je rýže, nicméně použití bakteriálních genů nemusí být při inženýrství C4 rýže preferováno.

Vyvinutí C4 dráhy do rýže

Předpokládalo se, že jednobuněčný C4 systém by mohl být rychleji instalován do C3 rostlin. Existují pokusy o inženýrství jednobuněčného systému C4 fotosyntézy také v rýži (Miyao et al. 2011). Za účelem zavedení jednobuněčné dráhy podobné C4, v níž je MC nucen zachycovat a uvolňovat CO2 způsobem, který probíhá u Hydrilla verticillata (L.f) Royle. byly v transgenních listech rýže nadprodukovány čtyři enzymy (PEPC, PPDK, NADP-MDH a NADP-ME) zapojené do této dráhy (Ku et al. 1999; Fukayama et al. 2001; Tsuchida et al. 2001; Taniguchi et al. 2008). Několik hlavních problémů, které se vyskytly a které je třeba vyřešit pro vytvoření jednobuněčné dráhy podobné C4 v rýži, jsou: mechanismus usnadňující transportní aktivitu PEP přes obal chloroplastu, import OAA do chloroplastů a směr reakce NADP-ME, zapojení NADP-MDH, přítomnost endogenního PEPC uvnitř MC chloroplastu rýže a další zvýšení aktivity NADP-MDH byly označeny za nezbytné (Miyao et al. 2011). Pozemní jednobuněčné C4 druhy jako Bienertia cycloptera, B. sinuspersici a Suaeda aralocaspica, patřící do čeledi Chenopodiaceae, také potřebují prostorovou kompartmentalizaci asimilace a dekarboxylace uhlíku (Chuong et al. 2006). Tyto druhy mají v těchto kompartmentech dimorfní chloroplasty. Dřívější pokusy přinesly marný cyklus, který byl způsoben tím, že nedošlo ke změně anatomie, chyběly vhodné transportéry a geny kukuřice transformované do rýže nebyly vhodně exprimovány buněčně specifickým způsobem a nebyly regulovány jako u kukuřice, ale byly regulovány jako endogenní C3 izoformy rýže (Miyao et al.

Aby bylo možné během dvou desetiletí upravit fotosyntetickou dráhu z C3 na C4, což v přírodě trvalo miliony let, zahájilo konsorcium C4 rýže souběžné objevování genů a inženýrství již známých genů do rýže s cílem vytvořit rýži C4 s anatomií Kranzova typu. Geny C4, jako jsou CA, PEPC, PPDK, NADP-ME a NADP-MDH, byly klonovány z kukuřice a transformovány do rýže. Také transportéry, které byly nadměrně exprimovány v metabolických drahách C4, jako je 2-oxoglutarát/malátový transportér (OMT1), dikarboxylátový transportér1 (DiT1), dikarboxylátový transportér2 (DiT2), PEP/fosfátový transportér (PPT1), mezofylový obalový protein (MEP) a triose-fosfát-fosfátový translokátor (TPT), které byly nedávno identifikovány pomocí proteomiky buněk BS a MS kukuřice (Friso et al. 2010) jsou transformovány do rýže (obr. 3). Členové konsorcia pro rýži C4 se také podílejí na objevování nových genů souvisejících s Kranzovou anatomií (Wang et al. 2013b). Po otestování budou slibné kandidátské geny řídící Kranzovu anatomii vneseny také do rostlin rýže, které byly upraveny pomocí genů biochemické dráhy C4.