3.1.2 Azidit
Atsidia pidetään yhtenä sopivimmista ryhmistä bioorthogonaalisiin reaktioihin ja klikkauskemiaan. Toisin kuin ketonit ja aldehydit, atsideja ei juuri esiinny biologisissa järjestelmissä. Azideilla on korkea oma energia, mutta niillä ei ole luonnollista reaktiokumppania (King ja Wagner, 2014), niillä on pieni koko ja neutraali kokonaisvaraus, ja lopuksi ne ovat kineettisesti stabiileja fysiologisissa olosuhteissa.
Staudingerin ligaatio (Staudinger ja Hauser, 1921) vaikuttaa hyvältä ehdokkaalta atsideja käyttäviin biokonjugaatioreaktioihin. Tässä reaktiossa atsidit reagoivat elektrofiilisen ansan sisältävien trifenyylifosfiinireagenssien kanssa tuottaen atsa-ylidivälituotteen, joka reagoi elektrofiilisen esterikarbonyyliryhmän kanssa muodostaen viisirenkaisen renkaan, joka käy läpi hydrolyysin tuottaen lopullisen stabiilin amidisidoksen (kuva 5.6A) (Steen Redeker ym., 2013; Staudinger ja Hauser, 1921). Tämän reaktion uusi muunnos kuvattiin pian sen jälkeen (King ja Wagner, 2014; Saxon ja Bertozzi, 2000; Saxon ym., 2000; Nilsson ym., 2000), jota kutsutaan ”jäljettömäksi Staudingerin ligaatioksi”, jossa lopullinen amidisidoksinen tuote vapautuu fosfiinioksidiryhmästä.
Kuva 5.6. Esimerkkejä biokonjugaatioreaktioista atsidien kanssa. (A) Staudingerin ligaatio; (B) kuparikatalysoitu atsidi-alkyyni-sykloaddition; (C) kantaa edistävä atsidi-alkyyni-sykloaddition; (D) sykloaddition oksanorbornadieenien kanssa. UAA, epäluonnolliset aminohapot.
Staudingerin ligointia on käytetty monissa eri sovelluksissa. Esimerkiksi Raines et al. sovelsivat tätä reaktiota kysteiinittömänä vaihtoehtona NCL:lle peptidien ligoimiseksi (Nilsson et al., 2001) ja yhdessä NCL:n kanssa keinotekoisen RNAaasi A:n kokoamisessa (Nilsson et al., 2005). Lisäksi sitä käytettiin muissa sovelluksissa, kuten proteiinien immobilisoinnissa kiinteälle alustalle in vitro- ja in vivo -kuvantamista varten (Saxon ja Bertozzi, 2000; Prescher ym., 2004), biomolekyylien merkitsemisessä in vitro ja in vivo (Saxon ja Bertozzi, 2000; Prescher ym., 2004), 2004; Vocadlo et al., 2003), proteiinien rikastamiseen (Vocadlo et al., 2003) ja havaitsemiseen (Charron et al., 2009) sekä (Lemieux et al., 2003) proteiinien modifiointiin.
Staudingerin ligaatioon liittyy kuitenkin joitakin haittoja. Nimittäin sen hidas kinetiikka (toisen kertaluvun nopeusvakio alhaisella 10-3 M-1s-1 -alueella) (Lin et al., 2005), fosfiiniyhdisteiden hapettumisherkkyys (fosfiinireagenssin suhteellisen suuria pitoisuuksia on käytettävä) ja fosfiinien mahdollinen ristireaktiivisuus disulfidien kanssa (Lang ja Chin, 2014; King ja Wagner, 2014).
Atsidit voivat reagoida alkyynien kanssa Cu(I)-katalysoidussa atsidi-alkyyni-sykladitiossa (CuAAC) tai 1,3-dipolaarisessa sykladitiossa (kuva 5.6B), joka on yksi tavallisimmista esimerkeistä klikkauskemian reaktioista (Rostovtsev ym, 2002; Tornøe et al., 2002). Tämä reaktio herättää suurta kiinnostusta biologisissa tieteissä sen hyvän selektiivisyyden, suuren saannon ja mietojen reaktio-olosuhteiden (huoneenlämpötila eri liuottimissa) vuoksi. Lisäksi sekä atsidit että alkyynit voidaan tuoda proteiineihin vaikuttamatta proteiinien rakenteeseen ja toimintaan (Steen Redeker et al., 2013). Atsidit ja alkynit voivat muodostaa hyvin nopeasti vakaan 1,2,3-triatsolilinkityksen fysiologisissa olosuhteissa Cu(I):n läsnä ollessa. Sharplessin ym. ehdottama mekanismi (Rostovtsev ym., 2002) kuvaa ensin terminaalisen alkynin pääsyä kupariasetylidiin ja sitä seuraavaa atsidin hyökkäystä (King ja Wagner, 2014). Viime aikoina tätä mekanismia on tarkennettu edelleen ja ehdotettu dikuparin välituotetta (Worrell et al., 2013). Tämän reaktion suurimmat haitat ovat Cu(I)-riippuvaiset sivureaktiot ja Cu(I)-sytotoksisuus (Baskin et al., 2007; Plass et al., 2011), jotka ovat rajoittaneet sen käyttöä lähinnä solunulkoisessa tilassa tapahtuvaan merkitsemiseen (King ja Wagner, 2014). CuAAC:tä on käytetty laajalti monissa erilaisissa biologisissa tutkimuksissa, esimerkiksi fosfolipidien leimaamiseen niiden kuvantamista varten in vivo (Jao et al., 2009) ja in vitro (Neef ja Schultz, 2009), virusten pinnan uudelleenmuotoiluun (Steinmetz et al., 2009), proteiinien modifiointiin/merkitsemiseen in vitro ja in vivo (Link ja Tirrell, 2003; Ngo ja Tirrell, 2011; Liu ja Schultz, 2010; Deiters ym., 2003), nukleiinihappojen merkitsemiseen (Weisbrod ja Marx, 2008) ja affiniteettipohjaiseen koettimien profilointiin (Speers ym., 2003).
Kuparin sytotoksisuuden voittamiseksi on kehitetty erilaisia lähestymistapoja. Nimittäin vesiliukoisten ligandien käyttö Cu(I)-koordinaatioon, kuparia kelatoivien orgaanisten atsidien käyttö ja rengaskannan tuominen alkyniosaan. Ensimmäisessä tapauksessa vesiliukoiset ligandit koordinoivat Cu(I):tä muodostaen aktivoidun kuparikatalyytin, joka kykenee edistämään CuAAC:n toimintaa matalilla mikromolaarisilla metallipitoisuuksilla vähentäen samalla Cu(I):n potentiaalista myrkyllisyyttä (Besanceney-Webler et al., 2011; Del Amo ja Wang, 2010; Hong et al., 2009; Kennedy et al., 2011). Toisessa tapauksessa tehokasta Cu(I)-konsentraatiota nostetaan reaktiokohdassa käyttämällä sisäistä kuparia kelaatiota sisältäviä atsidiligandeja (Brotherton et al., 2009; Kuang et al., 2010; Uttamapinant et al., 2012). Viimeisessä strategiassa käytetään alkyynejä, jotka on aktivoitu reagoimaan paremmalla kinetiikalla ilman katalyyttiä. Tältä osin syklooktyyniosuuksien käyttö lisää reaktiivisuutta rengasliitoksen vapautumisen seurauksena (Steen Redeker et al., 2013; Baskin et al., 2007; Plass et al., 2011). Kantaan perustuvasta atsidi-alkyyni-sykliliitoksesta (SPAAC) (kuva 5.6C) on tullut tehokas väline paitsi proteiinien ja vasta-aineiden merkitsemiseen myös muihin sovelluksiin, kuten vasta-aineettomiin Western Blot -analyyseihin (Boutureira et al., 2015), koska ylimääräisiä reagensseja tai myrkyllisiä metalleja, jotka voivat vahingoittaa biomolekyylejä, ei tarvita. Esimerkiksi Bertozzi et al. osoittivat sen soveltuvuuden puhdistettujen proteiinien modifiointiin (Baskin et al., 2007). Lisäkokeissa reaktiota sovellettiin onnistuneesti in vitro fibroblastisoluihin (Baskin et al., 2007). Lisäksi SPAAC:ia käytettiin kuvaamaan kasvaimia elävissä hiirissä nanohiukkasten avulla (Koo et al., 2012) ja 18F PET:llä, jossa fluori oli liitetty sekä atsidiin että sykloalkyyniin (Jeon et al., 2012). Muita sovellusalueita löytyi virusten modifioinnissa ja DNA:n merkitsemisessä (Qiu et al., 2013). Syklooktyynien monimutkainen synteesi ja se tosiasia, että niiden lisääntynyt bulkkisuus ja hydrofobisuus voivat kuitenkin vaikuttaa proteiinien rakenteeseen ja stabiilisuuteen (Kim ym, 2013), ja niiden lisääntynyt aktivoituminen voi edistää sivureaktioita luonnossa esiintyvien tiolien kanssa, voidaan pitää haittatekijöinä.
Elektronivajeiset sulfonyyliatsidit voivat myös reagoida aktivoitujen alkeenien (oksanorbornadieenit tai norborneenit) kanssa metallittomassa sykliliitoksessa (kuva 5.6D), joka on samankaltainen kuin spaakki-alkeniliitoksessa SPAAC-alkenin kanssa (Alder, 1930; Huisgen et al., 1980). Azidi-aleenisykladition tuote on kuitenkin suhteellisen epävakaa triatsoliini toisin kuin klassisessa klikkaussykladitiossa muodostuvat aromaattiset triatsolit. Oksanorbornadieeniä, joka on sekä kireä että elektronipuutteinen, käytettiin dipolarofiilina reaktiossa atsidien kanssa (van Berkel et al., 2008). Tässä tapauksessa oksanorbornadieenin jännitetty kaksoissidos reagoi atsidien kanssa muodostaen välituotteena olevan triatsoliinin, joka käy spontaanisti läpi retro-Diels-Alder-reaktion, jossa vapautuu furaania, mikä johtaa stabiiliin 1,2,3- tai 1,4,5-triatsoliin. Tätä reaktiota käytettiin oksanorbornadieenifunktionaalisen proteiinin ja atsidimodifioidun syklisen peptidin selektiiviseen biokonjugointiin vesipuskureissa. Vaikka oksanorbornadieenit ovat helpompia syntetisoida kuin niiden syklooktyiinivastineet, tämä sykloadditioreaktio on melko hidas eikä täysin kemoselektiivinen suhteessa muihin proteiineissa esiintyviin funktionaalisiin ryhmiin, mikä on saattanut rajoittaa sen laajamittaista käyttöä (Lang ja Chin, 2014; van Berkel et al., 2008).