1 JOHDANTO
Fosfolipidikaksoiskerroskalvot ovat hyödyllinen mallijärjestelmä biologisten solukalvojen lipidikaksoiskerroskomponenttien perustavanlaatuisten näkökohtien tutkimiseen ja erityisesti niiden kimmoisien ominaisuuksien selvittämiseen. Ne ovat amfipaattisten molekyylien itsejärjestäytyviä rakenteita, joiden fysikaaliset ominaisuudet muistuttavat läheisesti smektisten nestekiteiden ominaisuuksia. Lipidikaksoiskerrosmatriisiin voidaan sisällyttää sekä hydrofobisia että amfipaattisia molekyylejä, kuten proteiineja, muita lipidejä, peptidejä, steroideja ja kosurfaktantteja. Jatkuvina väliaineina pidettävien lipidikalvojen elastisia ominaisuuksia on käytetty erilaisissa tutkimuksissa, jotka ulottuvat paikallisista ilmiöistä, kuten lipidi-lipidi-, lipidi-proteiini- ja proteiini-proteiini-vuorovaikutuksista, koko solujen muodonvaihteluihin. Lisäksi kaksoiskerroksen nestemäistä hiilivetyluonnetta ylläpitävät fosfolipidien väliset molekyylien väliset vuorovaikutukset nanoskooppisessa mittakaavassa: polaaristen pääryhmien väliset sähköstaattiset ja dipoli-dipoli-vuorovaikutukset , vesimolekyylien välittämät vuorovaikutukset ja hiilivetyketjujen väliset van der Waalsin dispersiovuorovaikutukset.
Kaksoiskerroksen kalvojen pinnat eivät ole täydellisen tasomaisia eivätkä jäykkiä . BLM-järjestelmä on lähes kaksiulotteinen joustava rakenne, joka käy jatkuvasti läpi erilaisia konformaatio- ja dynaamisia siirtymiä . Lisäksi keinotekoiset ja luonnolliset BLM:t eivät ole eristäviä järjestelmiä, vaan läpäiseviä vedelle ja elektrolyyteille, jotka diffundoituvat niiden läpi erilaisten transmembraanihuokosten kautta.
Stokastiset transmembraanihuokoset syntyvät jommallakummalla seuraavista mekanismeista: sattumanvaraiset ja vinoutuneet lämpöheilahtelut (termoporaatio) ja sähköinen laukaisu (elektroporaatio). BLM:n sisällä olevat lipidimolekyylit noudattavat kolmea erillistä satunnaisten lämpöliikkeiden kategoriaa: sivusuuntaiset translaatiot, jotka ovat samansuuntaisia kaksoiskerroksen pinnan kanssa ja joiden sivusuuntainen diffuusiokerroin on suuruusluokkaa 10-7 m2s-1 (Dl) , värähtelyt ja rotaatiot lipidien akselien ympärillä kohtisuoraan kaksoiskerroksen pintaan nähden .
Sivusuuntaiset translaatiot, joiden suunta on satunnainen, aiheuttavat paikallisia lipidien polaaristen eturyhmien tiheyden heilahteluita kaksoiskerroksen pinnoilla. Tämän vuoksi kaksoiskerroksen pinnasta otettu tilannekuva paljastaa paikallisia nanoskooppisen kokoisia alueita, joissa polaaristen pääryhmien tiheys on suurempi (ts. klustereita), sekä vyöhykkeitä, joissa tiheys on pienempi. Tietyissä BLM:n fysikaalisissa olosuhteissa (pH, lämpötila, lipidikomponentit, sähkökemiallinen potentiaali jne.) jälkimmäiset vyöhykkeet edustavat kalvon pieniä paikallisia vikoja (eli tyhjiä paikkoja). Näillä alueilla vesimolekyylit voivat tunkeutua kaksoiskerroksen hydrofobiseen matriisiin. Tarkastellaan tapausta, jossa kussakin monokerroksessa on kaksi toisistaan riippumatonta vikaa, jotka on kohdistettu kohtisuoraan kalvon pinnalle. Ne voivat synnyttää sylinterimäisen hydrofobisen huokosen, jonka sisäpintaa reunustavat lipidien hydrofobiset ketjut. Tämän vuoksi tällaiset ohimenevät huokoset ovat luonteeltaan hydrofobisia. On myös mahdollista, että polaariset pääryhmät, jotka sijaitsevat hydrofobisen huokosen läheisyydessä, tottelevat rotaatioita sen sisäpuolelle. Tällöin huokosten sisäinen hydrofobinen pinta päällystyy polaarisilla pääryhmillä. Näin ollen nämä huokoset ovat luonteeltaan hydrofiilisiä, niillä ei ole enää lieriömäistä geometriaa ja ne ovat vakaampia kuin hydrofobiset huokoset . Toisin sanoen polaaristen otsaryhmien tiheyden satunnaiset termiset vaihtelut BLM:n kahdessa monokerroksessa pystyvät tuottamaan stokastisia transmembraanihuokosia.
Hydrofobisten paksuusvaihteluiden esiintyminen BLM:n sisällä osoitettiin sekä teoriassa että kokeessa. Tämä saavutettiin määrittämällä kaksoiskerroksen paksuuden (h) arvot kolmesta toisistaan riippumattomasta menettelystä: sähkökapasitanssimittaukset (hc) , optiset heijastusmittaukset (hr) ja suora laskenta (hav). Tanford (1980) laski kaksoiskerroksen paksuuden käyttämällä seuraavaa kaavaa hav = Nl M/ρ, jossa Nl, M ja ρ ovat lipidien lukumäärä pinta-alayksikköä kohti, hydrofobisten ketjujen molekyylipaino ja hydrofobisen vyöhykkeen tiheys. Hydrofobisten alueiden ”paksuusvaihtelujen” vuoksi hc:n pitäisi olla yhtä suuri kuin hav, mutta tässä tapauksessa molempien pitäisi olla polaarisen kerroksen paksuuden (htp) verran pienempi kuin hr: hc ≅ hav = hr-htp. Jos lipidikaksoiskerroksen paksuus olisi tasainen, hc:n olisi oltava yhtä suuri kuin hav. Binaarisesta lipidiseoksesta koostuvan BLM:n tapauksessa fosfolipidien välille syntyy valikoiva assosiaatio fosfolipidialueiden ilmaantumisen jälkeen. Niiden paksuus riippuu lipidikomponenttien hiilivetyketjun pituudesta . Popescu et al. (1991) osoittivat stokastisten huokosten esiintymisen BLM:ssä kaksoiskerroksen paksuuden vaihtelun vuoksi. Tällaisesta mekanismista johtuvan kalvon lävistymisen energiaesteen korkeus on kuitenkin suuri (noin 91 kT, jossa k on Boltzmannin vakio ja T absoluuttinen lämpötila). Tällöin huokosen geometrinen profiili on elliptisen toroidin muotoinen. Osoitettiin myös, että tällainen läpikulkeva huokos voi kehittyä stabiiliin tilaan . Tällä mallilla saadut tulokset olivat melko yllättäviä, koska tilastollisten huokosten sulkeutuminen kalvoissa tapahtuu nopeasti. Kaksi vuotta myöhemmin Zhelev ja Needham (1993) ovat luoneet suuria, kvasistabiileja huokosia lipidikaksoiskerrosvesikkeleihin, mikä vastaa edellisen mallin ennustusta . Moroz ja Nelson (1997) ovat laskeneet kalvon repeämiskestävyyden viivajännityksenä suurelle huokoselle kaksikerrosvesikkelissä .
Stokastiset transmembraanihuokoset voivat muodostua myös lipidien vinoutuneesta lämpöliikkeestä . Tätä mekanismia kutsutaan joskus termoporaatioksi. Huokoset syntyvät kalvoon termisesti indusoidun aktivointiprosessin kautta. Vaihtoehtoisesti huokosten muodostumisen aktivointiprosessi voidaan indusoida ulkoisen sähkökentän avulla (kutsutaan myös elektroporaatioksi) . Elektroporaation avulla syntyvä huokos on suurempi ja vakaampi . Sähköporaatiomekanismia ehdotettiin lääkkeiden ja geenien kuljettamiseen soluihin ja kudoksiin .
Transmembraaniproteiinihuokosia muodostavat proteiinipitoiset systeemit, jotka kattavat laajan kirjon pienistä peptidikanavista (esim. gramicidiini, alametisiini, melittiini jne.) suuriin proteiinien multimeerisesti koottuihin kanaviin . Koska nämä huokoset ovat suuria ja vedentäytteisiä, hydrofiiliset aineet, mukaan lukien ionit, voivat diffundoitua niiden läpi, jolloin kalvon sähköinen potentiaali häviää. Transmembraaniproteiinihuokoset koostuvat integraaliproteiineista, jotka kuuluvat kahteen suureen rakenneluokkaan: (1) selektiiviset kanavat, jotka muodostuvat niputetuista transmembraanisista a-kelikaalisista rakenteista, ja (2) selektiiviset kanavat, huokoset ja huokoset, jotka muodostuvat monomeerisistä (esim. OmpG), dimerisistä (esim. selektiiviset Cl-kanavat), trimeerisistä (esim. OmpF) tai multimeerisistä transmembraanisista ß-piippurakenteista (esim. α-hemolysiini, leukosidiineja, sytolysiinejä) . Lipidikaksoiskerrosta voidaan käyttää in vitro -järjestelmänä näiden proteiinikanavien tutkimiseen, kun ne rekonstruoidaan toimivaksi kalvoksi . Lisäksi BLM:iä voidaan käyttää välineenä kalvoproteiinien suunnittelussa ja sen sovelluksissa joko yhden molekyylin biofysiikassa tai biotekniikan alalla .
Toisessa esimerkissä Escherichia coli -bakteerin erittämä proteiini kolisiini Ia muodostaa jänniteohjattuja ionikanavia sekä kohdebakteerien sisäkalvolla että tasomaisissa BLM:issä . Colicin Ia on membraanikuljettaja, joka kuuluu bakteerimyrkkyjen luokkaan, joilla on sama strategia: ne asettuvat toisen ravinteiden kanssa kilpailevan bakteerin membraaniin, jolloin syntyy suurikokoisia huokosia. Näin ollen nämä huokoset vahingoittavat sähkökemiallisen kalvopotentiaalin ja lopulta aiheuttavat näiden kilpailevien bakteerien kuoleman. Edellä mainittuihin stokastisiin huokosiin verrattuna proteiinihuokosilla on erilainen muodostumismekanismi ja myös erilaiset ominaisuudet. Siinä missä stokastinen huokos ”unohtaa” syntymekanisminsa, joillakin transmembraaniproteiinihuokosilla (esim. kolisiini Ia) näyttää olevan ”muisti”-vaikutuksia, ainakin BLM:n sähköiseen stimulaatioon käytettävän tietyn pulssisarjan vaikutuksesta.
Geneettisiä huokosia tavattiin nisäkkäiden maksasta peräisin olevien sinusoidisten verisuonten seinämässä. Näiden verisuonten endoteelisoluissa on lukuisia seulalevyhuokosia . Nämä halkaisijaltaan noin 0,1 μm:n suuruiset huokoset mahdollistavat osan veriplasmasta ja kylomikronien kulkeutumisen sinusoiditilasta Dissen tilaan. Näin ollen endoteelihuokoset kontrolloivat nesteiden, liuottimien ja hiukkasten vaihtoa sinusoidiveren ja Dissen tilan välillä .
Tässä työssä käytimme jatkuvien väliaineiden kimmoteoriaa kuvaamaan stokastisten huokosten esiintymistä tasomaisten BLM:ien yli.