P74-26:n pääkapsidiproteiini käyttää ainutlaatuisia arkkitehtonisia piirteitä -lassoja, renkaita ja läppiä – kapsidin vakauden parantamiseksi. Kapsidin alayksiköiden rajapinnoilla havaitaan tehostuneita hydrofobisia vuorovaikutuksia. Hydrofobisten vuorovaikutusten arvioidaan olevan >2-kertaisia P74-26:ssa verrattuna muihin mesofiilisiin homologeihin (lisätaulukot 3 ja 4). Tämä havainto voi osittain selittää P74-26-kapsidin paremman termostabiilisuuden, sillä hydrofobinen vaikutus voimistuu korkeassa lämpötilassa32. Sen sijaan emme havainneet merkittävää muutosta vetysidosten tai suolasiltojen määrässä (lisätaulukot 3 ja 4), jotka ovat muita vuorovaikutuksia, joiden on havaittu lisäävän joidenkin globulaaristen proteiinien lämmönkestävyyttä33,34,35,36.
Emme olleet erityisen yllättyneitä havaitessamme lisääntyneitä hydrofobisia vuorovaikutussuhteita P74-26-kapsidissa. Lukuisat termofiilisten globulaaristen proteiinien tutkimukset osoittavat, että lisääntyneet hydrofobiset voimat ovat merkittävä tekijä lämpöstabiiliuden kannalta33,37,38,39,40. On kuitenkin kaksi asiaa, jotka tekevät P74-26-kapsidista ainutlaatuisen mallijärjestelmän: (1) Tiiviisti pakatun DNA:n aiheuttama korkea sisäinen paine aiheuttaa kapsidiin mekaanista rasitusta7,8,27 ja (2) se on itsekokoonpaneva rakenne, jossa alayksiköiden välisellä arkkitehtuurilla ja topologialla on tärkeä merkitys kokonaisstabiliteetin kannalta. Voimme johtaa nämä periaatteet vertaamalla P74-26:n rakennetta lukuisten mesofiilisten homologien rakenteisiin.
Havaitsimme, että P74-26:n kapsidia stabiloivat useat silmukat ja jatkeet, jotka muodostavat topologisia yhteyksiä alayksiköiden välille. Ainutlaatuinen E-silmukan lasso kiinnittyy viereisen MCP:n G-silmukkaan ja P-domeeniin, jotka toimivat kiinnityspylväinä lasson topologisessa sitomisessa. Lisäksi N- ja C-kaaret yhdessä Dec-kaaren kanssa kiertävät kokonaan E-silmukan β-säikeet, mikä on toinen P74-26:n ainutlaatuinen arkkitehtoninen elementti (kuva 5e). E-silmukka on siis rengastettu tyven suuntaan ja lassotettu kärjen suuntaan.
Toisen lasson muodostaa N-kaari, joka muodostaa sekä kapsomeerin sisäisiä että kapsomeerien välisiä vuorovaikutuksia. N-kaari sitoutuu kapsomeerin sisällä olevan viereisen MCP:n E-silmukkaan yläkaaren säikeen, kyynärvarren spiraalin ja käden alueen kautta (Kuva 5a, c). Lisäksi kyynärpää, kyynärvarsi ja käsi stabiloivat kapsomeerin ja kapsomeerin välisiä vuorovaikutuksia sitoutumalla DecP74-26:een ja MCP-alayksikköön, joka sijaitsee poikkisuuntaisesti kaksoiskappaleen/kvasi-kaksoiskappaleen akselilla (Kuva 6a, b). Vaikka N-käsi ei teknisesti ole suljettu silmukka, P74-26 sulkee silmukan tehokkaasti käyttämällä ainutlaatuista S-silmukkaa kyynärvarren ja käden alueiden asennon kiinnittämiseksi (kuva 6c). Emme löydä vastaavaa N-varren lasso-arkkitehtuuria mesofiilisistä Caudoviruksista31,41,42,43,44,45,46, mikä viittaa siihen, että tämä arkkitehtuuri on tärkeä kapsidin stabiilisuuden lisäämiseksi.
Vaikka lassoja ei löydy muista Caudoviruksista, kaukana sukulaisina olevissa herpesviruksissa on analoginen lasso-arkkitehtuuri HK97:n taitoksen N-varressa47,48,49. P74-26:n N-kaaren tavoin herpesvirusten N-kaaren lassot eivät ole todellisia suljettuja silmukoita. Tästä näennäisestä samankaltaisuudesta huolimatta herpesvirusten lassot toimivat eri tavalla. Ne stabiloivat yksinomaan kapsomeerien välisiä vuorovaikutuksia, kun taas P74-26:n N-varren lasso stabiloi sekä kapsomeerien sisäisiä että kapsomeerien välisiä vuorovaikutuksia. Lisäksi herpesviruskapsidien pentoneissa ei ole lassovuorovaikutuksia ja vuorovaikutukset vaihtelevat heksonien alayksiköiden sisällä, kun taas P74-26:lla on lähes identtiset lassovuorovaikutukset sekä pentoneissa että heksoneissa. Nämä havainnot osoittavat, että lasso-arkkitehtuuri on todennäköisesti kehittynyt itsenäisesti, ja korostavat topologisten stabilointimekanismien joustavuutta. Oletamme, että laajennettava varsiarkkitehtuuri helpottaa vahvempien vuorovaikutusten kehittymistä itsekokoonpanevissa järjestelmissä, kuten kapsidissa. Näitä avoimia silmukoita voidaan helposti tehostaa yksittäisten jäämien sarjallisella pidentämisellä. Ehkä tämä evoluution helppous on syynä siihen, että pidennettyjä käsivarsien lassoja esiintyy sekä P74-26- että herpesviruksissa. Nämä pidennetyt lassot ovat samankaltaisia kuin N- ja C-terminaaliset pidennykset, jotka välittävät kokoonpanoa muissa viruksissa (esim. C-terminaaliset pidennykset SV40-kapsidin vaippaproteiineissa50). Odotamme, että tämäntyyppiset pidennetyt lassot voivat olla käyttökelpoisia vakaampien kapsidien ja muiden itsekokoonpanevien hiukkasten suunnittelussa.
Lasso-arkkitehtuurin toinen etu on, että se voi omaksua vähemmän pidennetyn konformaation. P74-26 MCP:ssä on kaksi lassoa HK97-taitteen molemmissa päissä, jotka molemmat ovat oletettavasti paljon pienemmässä prokapsidissa. Käyttämällä näitä lassorakenteita P74-26 voi säilyttää suuren stabiilisuuden ja tarjota samalla konformaatiojoustavuutta, jotta se voi laajentua kypsymisen aikana. Oletamme, että lassot eivät ole yhtä pitkät prokapsidissa; kapsidin laajentuessa lassot saavuttavat täyden pituutensa, jolloin ne lukkiutuvat paikoilleen. Kypsässä kapsidissa havaittu täysi laajeneminen tarjoaisi jännitteellisen eheyden, kuten jäljempänä käsitellään.
P74-26 käyttää toisiinsa nivoutuvia läppiä topologisesti vakauttamaan kapsomeerien välisiä kontakteja. T-silmukka vakauttaa kapsomeerien välisiä vuorovaikutuksia asettumalla viereisen kapsomeerin MCP-alayksikön P-domeenin uraan. Nämä T-silmukan vuorovaikutukset kiertävät kapsidin sisäpintaa pitkin kolminkertaisia/kvasi-kolminkertaisia akseleita (kuva 7b; täydentävä kuva 7b). Vastaavasti kapsomeerien väliset kaksoiskertaiset/kvasi-kaksoiskertaiset vuorovaikutukset stabiloituvat kapsidin ulkopinnalla N-varsien lomittuneen järjestelyn ansiosta (Kuva 7c; Täydentävä kuva 7a). Nämä päällekkäiset rakenteet muistuttavat liikkuvassa laatikossa olevien läppien lomittunutta järjestelyä. Tällä tavoin kapsidin ulko- ja sisäpinnat vakautetaan kahdella erillisellä lomittuvalla läppävuorovaikutuksella. Ehdotamme, että symmetria- ja kvasisymmetria-akseleilla havaitut liikkuvat laatikkojärjestelyt vahvistavat kapsidia huomattavasti sisäistä painetta vastaan, koska niitä on topologisesti haastavaa häiritä. Nämä järjestelyt ovat kuitenkin oletettavasti myös haastavia koota, mikä herättää tärkeän kysymyksen siitä, miten P74-26-kapsidi kootaan lomittuvalla arkkitehtuurilla.
P74-26:n koristeproteiini omaksuu niin ikään ainutlaatuisen rakenteellisen järjestelyn, joka vaikuttaa merkittävästi kapsidin termostabiilisuuteen. Koristeproteiinit lisäävät kapsidin stabiilisuutta28,29,51, vaikka muitakin tehtäviä on esitetty52. DecP74-26:n trimeeri vakauttaa kolminkertaiset/kvasi-kolminkertaiset akselit. Mesofiilisiin Caudoviruksiin verrattuna DecP74-26-trimeri on vuorovaikutuksessa useampien alayksiköiden kanssa paljon suuremmalla vuorovaikutusalueella (kuva 8a). Kokonaisvuorovaikutusalue DecP74-26-alayksikköä kohti on varsin huomattava: ~4100;Å2 146-residuen proteiinille. Aiempi tutkimuksemme osoitti, että DecP74-26 on huomattavasti stabiilimpi kuin sen mesofiiliset homologit, ja tämä stabiloituminen tapahtuu pääasiassa muodostamalla poikkeuksellisen tiivis trimeeri23. Trimerisaatiovuorovaikutukset muodostavat kuitenkin vain pienen osan DecP74-26:n kokonaisvuorovaikutuspinta-alasta (~18 % kokonaisvuorovaikutuspinta-alasta DecP74-26:n alayksikköä kohti). Tämä viittaa siihen, että DecP74-26:n vuorovaikutus kapsidin kanssa edistää merkittävästi vakautta.
DecP74-26:n trimeerien väliset vuorovaikutukset muodostavat kapsidia koossa pitävän häkin (kuva 8b). Tämä järjestely on ainutlaatuinen P74-26:lle. Esimerkiksi faagit lambda ja TW1 käyttävät hyvin samankaltaista Dec-proteiinin taittoa23 , mutta niiden Dec-varren vuorovaikutus muiden kapsidiproteiinien kanssa on paljon rajoitetumpaa29,44. Lisäksi faagi L:n toisiinsa liittymätön koristeproteiini ei ole yhteydessä viereisiin trimeereihin, ja itse asiassa se puuttuu kvasikolminkertaisilta akseleilta52. T4-faagi on koristeltu Soc-proteiinilla, joka on vuorovaikutuksessa viereisten Soc-alayksiköiden kanssa kolminkertaisilla ja kvasikolminkertaisilla akseleilla; Socia on kuitenkin suhteellisen vähän (~50 %), joten häkki on epätäydellinen41. Koska koristeproteiinit puuttuvat yleensä prokapsidista29, odotamme, että DecP74-26-häkki kasaantuisi yhteistyössä kapsidin laajentuessa kapsidin vakauttamiseksi. Tulevissa kokeissa selvitetään yhteistyökykyisyyden roolia kokoonpanossa ja stabiilisuudessa.
P74-26 MCP:n ja Decin arkkitehtuurin parannukset tarjoavat stabilointia suurta sisäistä painetta vastaan. Miten sisäisen paineen aiheuttamat voimat vaikuttavat kapsidiin ja miten kapsidin arkkitehtuuri kestää näitä rasituksia? Jos oletetaan, että kapseloidun DNA:n aiheuttama paine jakautuu tasaisesti isometrisen kapsidin ympärille, kaikkiin kapsidin pisteisiin kohdistuu voimavektori, joka on kohtisuorassa kapsidin pintaa vastaan. Analogisesti kapsidiin kohdistuu voimia, jotka ovat samanlaisia kuin ilmapallossa. Siten sisäinen paine aiheuttaa sivuttaisjännityksiä kapsidin vuorovaikutukseen. Vaikka faagin korkea sisäinen paine haastaa kapsidin stabiilisuuden, se voi mahdollistaa myös tensegrityyn perustuvat stabiilisuusmekanismit. On mahdollista, että sisäinen paine voidaan valjastaa tuottamaan hiukkanen, joka stabiloituu yksittäisiin alayksiköihin kohdistuvan stressin avulla. Tätä tukee se, että pikornaviruskapsidit, jotka kamppailevat huomattavasti pienemmän sisäisen paineen kanssa, voidaan vakauttaa kapsidiin tehtävillä pienillä muutoksilla53.
P74-26:n kapsidin arkkitehtuuri on rakennettu kestämään lateraalista rasitusta tensitiivisen eheyden avulla. Tensionaalinen eheys eli tensegrity on yleistetty arkkitehtuurin stabiliteettimekanismi, johon kuuluu rakenteellisia alueita, joita pitää yhdessä joustavien elementtien verkosto, joka on jatkuvan jännityksen alaisena54. P74-26-kapsidissa A- ja P-domeenit ovat strukturoituja alueita, ja lassot ja pidennetyt varret ovat joustavia elementtejä, jotka välittävät jännitystä. Esimerkiksi E-silmukan lasso kiristyy G-silmukan ja naapurin P-domeenin muodostamaa kiinnityspylvästä vasten. Samoin N-varsi muodostaa lasson, jonka pää pysyy paikallaan S-silmukalla, joka lukittuu kyynärvarren ja käden väliseen uraan (kuva 6c). Näin ollen ennustamme, että S-silmukalla on catch bondin tunnusmerkit, ei-kovalenttisen sidoksen, joka vahvistuu jännityksen alaisena55. Lisäksi P74-26:n kapsidissa on useita läppiä, jotka lomittuvat toisiinsa. Nämä vuorovaikutukset vastustaisivat topologisesti sisäisen paineen aiheuttamia sivu- ja pitkittäisjännityksiä. Kokonaisuutena nämä lasso- ja läppäelementit käyttävät jännitystä kapsidin rakenteellisen pettämisen vastustamiseen. Tässä havaittu tensegrity-mekanismi on yksinkertaisesti kehittyneempi esimerkki kapsidin tensegritystä, jota Caspar ehdotti vuosia sitten56.
Lasso-, läppä- ja käsivarsi-interaktiot on sijoitettu siten, että sisäinen paine jakaa jännityksen useille sidoksille. Esimerkiksi E-silmukan β-arkki kokee voimia arkin akselin suuntaisesti. Näin ollen kaikki sidokset, jotka pitävät levyn koossa, joutuvat jännityksen alaisiksi pikemminkin kuin ortogonaalisessa geometriassa, jossa jännitys kohdistuu vain levyn päässä oleviin sidoksiin. Kapsidin rikkoutuminen edellyttäisi monien sidosten samanaikaista katkeamista (leikkausgeometria) eikä purkautuvaa geometriaa, jossa sidokset repeävät yksi kerrallaan57. Uraauurtavat yksittäisten molekyylien tutkimukset ovat osoittaneet, että leikkausgeometria vaatii paljon suurempia voimia rikkoutuakseen kuin jos voimat vaikuttavat purkautuvassa geometriassa58,59,60. Näin ollen P74-26:n kapsidi on rakennettu siten, että lateraaliset voimat vaikuttavat leikkaavassa geometriassa, mikä johtaa korkeaan tensegritykseen.
Kapsidin ainutlaatuisen stabiloivan arkkitehtuurin lisäksi P74-26:ssa käytetään myös ei-kanonista mekanismia kapsidin kapasiteetin muuttamiseksi. P74-26:n kapsidi on suurempi kuin useimmilla Caudoviruksilla, mikä korreloi sen epänormaalin suuren genomin kanssa. Useimpien T = 7 Caudovirusten genomin koko on 30-50 kb (lisätaulukko 2), kun taas faagi P74-26:n genomi on lähes kaksi kertaa niin pitkä, 83 kb24. Genomin koon perusteella olimme ennustaneet, että kapsidin koko olisi T = 12 (keskimääräinen genomin koko ~80 kb61), vaikka T = 9 tai T = 13 olisi ollut mahdollinen (keskimääräinen genomin koko ~70 tai ~120 kb). P74-26-kapsidi saavuttaa tämän suuremman koon kasvattamalla merkittävästi kapsomeerin kokoa pikemminkin kuin muuttamalla ikosaedrin monimutkaisuutta. Kapsomeeri on suurempi, koska P74-26:n MCP peittää normaalia enemmän pinta-alaa huolimatta MCP:lle tyypillisestä pituudesta. Näin ollen kapsomeeri on hieman normaalia ohuempi (kuva 4b). Näin ollen MCP:n jäännösten lukumäärä ei ennusta katettua kokonaispinta-alaa eikä genomin koko ennusta kolmiomäärää.
Bayfield ym.62 määrittivät hiljattain rakenteen läheisesti sukua olevalle T = 7 termofiiliselle faagille, joka käyttää vastaavalla tavalla suurennettuja kapsomeereja kapsidikapasiteetin lisäämiseksi. Tietojemme mukaan tämä on ei-kanoninen mekanismi kapsidikapasiteetin lisäämiseksi. Kapsidin suurentamiseen on kaksi klassista mekanismia: (1) triangulaatioluvun lisääminen ja (2) isometrisen pään muuttaminen prolateiksi. Ensimmäisessä tapauksessa heksoneita lisätään kapsidin kaikille pinnoille, kun taas jälkimmäisessä tapauksessa heksoneita lisätään kymmenelle ikosaedrin pinnalle siten, että kapsidia pidennetään yhdessä ulottuvuudessa (kuva 9). Molemmissa tapauksissa kapsomeerit pysyvät samankokoisina. Tässä olemme tunnistaneet kolmannen mekanismin suuremman kapsidin evoluutiolle: kapsomeerin koon kasvattaminen.
Kapsidin kapasiteetin kasvattamisen mekanismit. P74-26 omaksuu uudenlaisen mekanismin kapsidikapasiteetin lisäämiseksi kasvattamalla kapsomeerien kokoa ja säilyttämällä samalla T = 7 -geometrian
Näillä kolmella mekanismilla on hyvin erilaiset evoluutioesteet. Kaksi klassista mekanismia voidaan toteuttaa yksinkertaisilla mutaatioilla, ja ne on havaittu lukuisia kertoja. Monissa viruksissa yksinkertaiset pistemutaatiot muuttavat kolmiolukua5,63,64. Lisäksi joidenkin kapsidien triangulaatiolukua voidaan muuttaa muuttamatta MCP-sekvenssiä3,65,66. Samoin T4-faagin yksittäiset pistemutaatiot muuttavat kapsidin prolateista isometriseksi tai synnyttävät jättimäisiä päitä, joissa prolate-pään pitkä akseli on pidentynyt4,67. Näin ollen evolutiiviset esteet kapsidin tilavuuden muuttamiselle näiden kahden klassisen mekanismin avulla näyttävät olevan melko vähäiset. Sitä vastoin tässä havaittu suurennetun kapsomeerin strategia edellyttää useita ja laajoja muutoksia kapsidiproteiinien sekvensseissä. Suurempi P74-26-kapsidi edellyttää suuria muutoksia kahdeksaan erilliseen MCP-rakenteen modifikaatioon sekä Dec-kaareen (kuvat 3a, b ja 4c, d). Tämä herättää kysymyksen: miksi faagi P74-26 käytti tätä näennäisesti haastavampaa evoluutiostrategiaa eikä helpompia, klassisia strategioita? Mitkä rajoitukset estivät suuremman kapsidin kehittymisen klassisia reittejä käyttäen?
Ensimmäinen hypoteesimme on, että P74-26-kapsidia stabiloivat lassot, läpät ja käsivarret vaativat toimiakseen suuremman kapsomeerin. On mahdollista, että lassot tarvitsevat lisätilaa avautuakseen riittävästi, jotta kiinnityspylväsrakenne mahtuu sisään. Samoin läpät ja varret saattavat vaatia tietyn pituuden saadakseen aikaan stabiloivan toimintansa. Jos näin olisi, kapsidia stabiloivat arkkitehtoniset elementit tarvitsisivat normaalia suurempia kapsomeereja. Tässä skenaariossa suurempi kapsomeri on valikoitunut rakennepiirre ja T = 7 -geometria on spandreli: biologinen rakenne, joka on pikemminkin evoluution sivutuote kuin suoran valinnan tulos68. Emme kuitenkaan kannata tätä hypoteesia, koska lassoja esiintyy herpesviruksissa, joille HK97-taitos on tyypillisen kokoinen (Herpesvirusten MCP:llä on useita muita tornidomeeneja, jotka kasvattavat kokoa, mutta nämä domainit eivät ole osa kapsidin pääkerrosta eivätkä ne vaikuta HK97-taitokseen49). Lisäksi muut Caudovirusten MCP:t sisältävät pitkiä N-kaaria (esim. Sf6-faagi31) tai E-silmukoita, jotka avautuvat lähes yhtä leveiksi kuin P74-26 (esim. P22-faagi43), mutta nämä proteiinit ovat tyypillisen kokoisia. Tätä hypoteesia ei kuitenkaan ole vielä testattu.
Toinen hypoteesi on, että genomin koko ja kapsidikapasiteetti ovat kehittyneet yhdessä pienten samanaikaisten lisäysten kautta. Jos esi-faagin genomi on kehittynyt hieman suuremmaksi kuin kapsidiin mahtuu, voi olla valikoivaa painetta hieman suurempaan kapsidiin. T-määrän kasvattaminen tai siirtyminen prolate-päähän kasvattaa kapsidin tilavuutta huomattavasti, mikä johtaa sisäisen paineen suureen laskuun. Näitä siirtymiä voidaan ehkäistä, koska sisäinen paine on säilytettävä infektion kannalta26. Suurten sisäisen paineen muutosten välttämiseksi suuremmat kapsidit voivat hitaasti kehittyä yhdessä suuremman genomin kanssa.
Viimeinen hypoteesimme on, että kapsidin geometrialla on suora vaikutus kapsidin kokonaisstabiliteettiin. Hypoteesimme on, että T = 7 -geometria on luonnostaan vakaampi kuin korkeammat kolmioluvut heksonien vaihtelevien konformaatioiden vuoksi. Kaikissa kapsidissa, joiden T = 9 tai suurempi on, on useampi kuin yksi heksonityyppi, kun taas kaikissa kapsidissa T ≤ 7 on täsmälleen yksi heksonityyppi (paitsi T = 1, jossa ei ole heksoneja69,70). Esimerkiksi T = 7:ssä on yhden puseron heksonikonformaatio, kun taas T = 9:ssä on sekä siivekkäitä että litteitä heksoneja (täydentävä kuva 11a, b). Huomaamme myös, että prolate-kapsideissa on useita heksonityyppejä (yleensä kolme tai useampia heksonikonformaatioita; kuva 9). Näin ollen T > 7 -virusten tärkeimpien kapsidiproteiinien on sopeuduttava heksonien konformaatioheterogeenisuuteen, mikä voi vaikuttaa haitallisesti stabiilisuuteen.
Hypoteesimme on, että T = 7 -geometria on korkein kompleksisuus (eli suurin koko), joka on luonnostaan stabiili. Monimutkaisemmat geometriat aiheuttaisivat epävakautta heksonikonformaation vaihtelun kautta. Tämä luontainen epävakaus saattaa vaatia ylimääräisiä vakautusmekanismeja lieventääkseen, kuten koristeproteiineja, jotka sementoivat rakenteen paikalleen. Näkemyksemme mukaan T > 7 -geometrialla on kaksi haittaa, jotka eivät sulje toisiaan pois. Ensinnäkin jokaisen erillisen heksonikonformaation on pysyttävä toiminnallisena ja vakaana, mikä rajoittaisi MCP-proteiinien evoluutiota kohti suurempaa vakautta. Toinen etu on se, että pienempi kolmiomäärä johtaa pienempään määrään alayksiköiden välisiä rajapintoja, mikä minimoi kapsidin heikkojen kohtien määrän. Tämän hypoteesin tueksi extremofiilinen, arkeaalinen virus HSTV-2 (Halorubrum sodomense tailled virus 2) pakkaa ~68 kb:n genominsa T = 7 head71:een. HSTV-2 käyttää normaalia suurempaa kapsidia, ja sillä on myös trimeerisiä koristeproteiineja, jotka istuvat kolminkertaisella/kvasi-kolminkertaisella akselilla. Se, että tämä kapsidin suurennusmekanismi on havaittu vain extremofiileillä, tukee ajatusta, että T = 7 -geometrialla on suotuisa vaikutus stabiilisuuteen. Hypoteesimme tueksi voidaan todeta, että kaikki tunnetut T > 7 -kapsidit käyttävät (tietojemme mukaan) koristeproteiineja, kun taas monista T = 7 -viruksista puuttuu koristeproteiineja.
Jos eri kolmioluvuilla on erilainen luontainen stabiilisuus, tämä viittaisi siihen, että kullakin geometrialla on heikkoja kohtia kapsidin eri alueilla, kuten teoreettisessa työssä on ennustettu72. Oletamme, että kolminkertaiset/kvasi-kolminkertaiset akselit edustavat heikkoja kohtia T = 7 -ristikossa. Tämän hypoteesin tueksi voidaan todeta, että T = 7 -kaudovirusten koristeproteiineja esiintyy yleisesti kolminkertaisilla/kvasi-kolminkertaisilla akseleilla (lisätaulukko 2)29,44,52. Lisäksi näitä akseleita stabiloivat kovalenttiset ristisidokset HK97-faagissa45 ja T-silmukkaläpät P74-26:ssa (kuva 7b). Tutkiaksemme tätä ajatusta tarkemmin toteamme, että myös T = 9 -faagit käyttävät koristeproteiineja kolminkertaisilla akseleilla73,74, kun taas T = 12- ja T = 13 -faagit käyttävät koristeproteiineja kapsomeerien keskipisteissä61,75,76.
Huomautamme, että kaikki analyysimme on keskittynyt ensisijaisesti Caudoviruksiin. Nämä virukset eivät yleensä hajota kapsidiaan osana elinkaartaan, joten kapsidilla ei ole valikoivaa painetta olla labiili. Itse asiassa pakatun DNA:n suuri paine aiheuttaa suuren valikoivan paineen vakaiden kapsidien kehittymiselle. On todennäköistä, että muuntyyppiset virukset käyttävät erilaisia stabiilisuusmekanismeja, erityisesti virukset, jotka purkavat kapsidinsa välttämättömänä osana elinkaartaan.