- Esittely
- Kloroplastien lukumäärän ja koon lisääminen riisin nipun vaippasoluissa
- Vähentää suonivälejä ja kasvattaa siten suonitiheyttä lehdessä
- Calvinin syklin aktiivisuuden pitäisi vähentyä merkittävästi MC:ssä ja lisääntyä huomattavasti riisin BSC:ssä
- Fotorespiraatio mesofyllisoluissa on vähennettävä huomattavasti
- C4-polun suunnittelu riisiin
Esittely
Voidaksemme tarjota riittävää ruokaa ja ravintoa maapallon väestölle, jonka odotetaan kasvavan yhdeksään miljardiin vuoteen 2050 mennessä (http://www.unpopulation.org), riisin sadon on kasvettava vähintään 60 prosenttia (FAO 2009). Riisi on peruselintarvike yli puolelle maailman väestöstä, ja tämä riisiä käyttävä väestö kasvaa 1,098 prosenttia vuodessa (http://esa.un.org/wpp/Excel-Data/population.htm). Kasvava väestö merkitsee elintarvikkeiden, veden ja maan kysynnän lisääntymistä samaan aikaan, kun maatalouden luonnonvarojen perusta heikkenee, koska suuria peltoalueita siirretään elintarvikkeiden tuotannosta teollistamiseen ja biopolttoaineiden tuotantoon. Arvaamaton ilmastonmuutos uhkaa entisestään vähentää maatalouden kannalta käyttökelpoista maata kuivuuden ja tulvien lisääntymisen vuoksi (http://www.fao.org/docrep/017/aq191e/aq191e.pdf). Koska kasvava väestö ja maailmanlaajuinen ilmastonmuutos aiheuttavat yhä suurempia paineita maailman elintarvikehuollolle, on olennaisen tärkeää, että jatkamme viljelykasvien tuottavuuden parantamista viljan tuottavuuden osalta, jotta pysymme väestönkasvun tahdissa. Vihreän vallankumouksen aikana luotujen kasvityyppien aikaansaama viljelykasvien tuottavuuden kasvu tuki kahden maailmansodan jälkeistä väestönkasvua. Sittemmin parannetuista lajikkeista ja kehittyneestä teknologiasta huolimatta nykyisten riisilajikkeiden satopotentiaali on parantunut vain vähän, mikä osoittaa, että nämä lajikkeet ovat saavuttaneet satokattonsa (Akita 1994). Viime aikoina riisin satopotentiaalia on yritetty kasvattaa kehittämällä riisiin tehokas C4-tyyppinen fotosynteesi (Kajala ym. 2011). Tätä varten riisiin on lisättävä joukko geenejä, jotka säätelevät lehtien anatomiaa ja biokemiallisia prosesseja, ja ne on ilmentävä sopivalla tavalla, mikä ei tällä hetkellä ole mahdollista pelkästään perinteisillä kasvinjalostustekniikoilla. Näin ollen geenitekniikka riisin fotosynteesireitin parantamiseksi tarjoaisi riittävät mahdollisuudet parantaa todellista jyvien tuottavuutta ja satopotentiaalia. Geenitekniikka tarjoaa tehokkaan ja täsmällisen jalostustyökalun, jossa vain kiinnostavat geenit voidaan ottaa käyttöön jopa kaukana toisistaan olevista lajeista.
Riisin kaltaisissa C3-kasveissa hiilidioksidi assimiloituu kolmihiiliseksi yhdisteeksi fotosynteettisen entsyymin, ribuloosa-1,5-bisfosfaattikarboksylaasioksygenaasin (Rubisco) avulla. Kuten nimestä käy ilmi, Rubisco katalysoi myös ribuloosi-1,5-bisfosfaatin (RuBP) hapettumista fotorespiraatioksi kutsutussa turhassa prosessissa, joka voi aiheuttaa jopa 25 prosentin menetyksen aiemmin sitoutuneesta hiilestä (Sage 2004). Yli 30 °C:n lämpötilassa, joka on tyypillinen maailman trooppisilla riisinviljelyalueilla, hapettumisnopeus kasvaa huomattavasti, ja tämä vähentää C3-kasvien fotosynteesitehokkuutta huomattavasti, jopa 40 prosenttia (Ehleringer ja Monson 1993). Näin ollen riisin fotosynteesi muuttuu tehottomaksi tropiikissa ja lämpimillä lauhkeilla alueilla. C4-kasvien, joiden lehdissä on hiilidioksidia keräävä mekanismi, valohengitys on huomattavasti vähäisempää, joten ne ovat kehittyneet menestymään kuumissa ja kuivissa ympäristöissä ja tarjoavat arvokkaita tietoja viljelykasvien parantamisstrategioita varten. Riisi, jossa on C4-fotosynteesimekanismi, voisi lisätä fotosynteesin tehokkuutta ja käyttää samalla niukkoja resursseja, kuten maata, vettä ja lannoitteita, erityisesti typpeä, tehokkaammin (Hibberd et al. 2008). Koska se toimii hyvin korkeissa lämpötiloissa ja vaatii vähemmän vettä ja typpeä, C4-riisi hyödyttäisi erityyppisiä riisiekosysteemejä, myös marginaalimaita.
C4-tyyppinen fotosynteesi on yksi kolmesta biokemiallisesta mekanismista, joita kasvit käyttävät sitoakseen ilmakehän hiilidioksidia, ja muut ovat C3- ja Crassulacean-happoainemetabolian (CAM) polut. C4-fotosynteesi on kehittynyt yli 66 kertaa itsenäisesti (Sage et al. 2012) ainakin 19 suvussa angiospermaisten evoluution aikana C3-esivanhemmista (Muhaidat et al. 2007), ja siihen liittyy solurakenteiden, biokemian ja siten myös lehtien kehityksen vaihtelua. Tämä erittäin erikoistunut fotosynteesin muoto on olennaisesti kehittänyt CO2-konsentraatiomekanismin Rubisco-entsyymin ympärille, mikä poistaa Rubiscon oksygenaasitoiminnon ja vähentää siten fotorespiraation aiheuttamaa energian tuhlausta (Douce ja Heldt 2000). C4-lajien Rubisco on tehokkaampi karboksylaation suhteen kuin C3-lajien (Kubien et al. 2008). Muita C4-järjestelmään liittyviä etuja ovat korkeampi vedenkäytön tehokkuus, koska jyrkempi konsentraatiogradientti hiilidioksidin diffuusiota varten voidaan ylläpitää osittain suljettujen stomata-aukkojen kautta, korkeampi säteilynkäytön tehokkuus, koska C4-fotosynteesin hyötysuhde ei kyllästy suurella valon intensiteetillä (Rizal ym. 2012), ja korkeampi typen käytön tehokkuus, koska se vaatii vähemmän Rubiscoa ja siten vähemmän typpeä.
C4-kasvit ovat potentiaalisesti tuottavampia korkeammissa lämpötiloissa, jotka tyypillisesti vallitsevat riisin kohdalla. Tämän tehokkaamman fotosynteettisen järjestelmän hyödyntämiseksi aikana, jolloin väestömäärä ja elintarvikkeiden hinnat nousevat, on pyritty lisäämään maissin kaltaista C4-mekanismia riisiin (Rizal et al. 2012). Tämä uusi lähestymistapa riisin fotosynteesijärjestelmän muuttamiseksi on haastava ja pitkäaikainen hanke, koska C4-reitti on hyvin monimutkainen ja monet mekanismia ohjaavat tekijät ovat vielä tuntemattomia. Siksi se edellyttää eri tieteenalojen, kuten geenitekniikan, biokemian, bioinformatiikan, molekyylibiologian, fotosynteesin, systeemibiologian, fysiologian, kasvinjalostuksen, metabolomiikan jne. tutkijoiden kekseliäisyyttä ja asiantuntemusta. Tätä varten perustettiin C4-riisikonsortio, joka aloitti C4-riisitekniikan käytännön työn vuodesta 2009 lähtien (http://photosynthome.irri.org/C4rice/). Tässä katsauksessa esitetään ajantasainen katsaus C4-riisin kehittämisen vaatimuksiin ja geenitekniikan alalla saavutettuun edistykseen. Tutkimuksen perusteella, joka koskee C4-lajin evoluutiota C3-lajista ja siihen liittyviä muutoksia, seuraavat muutokset ovat välttämättömiä toimivan C4-fotosynteesireitin luomiseksi riisiin.
Kloroplastien lukumäärän ja koon lisääminen riisin nipun vaippasoluissa
Riisissä yli 90 % kaikista kloroplastien kokonaismäärästä sijaitsee lehden mesofyllisoluissa (MC) (Yoshimura ym. 2004); kun taas C4-kasveissa sekä MC-soluissa että nipun vaippasoluissa (BSC) on yhtä monta kloroplastia (Kuva 1A ja B). Tämä johtuu siitä, että C3-kasveissa koko fotosynteesiprosessi tapahtuu MC:ssä, mutta C4-kasveissa fotosynteesiprosessi on lokeroitu MC:hen ja BSC:hen. MC:t suorittavat ensimmäisen hiilidioksidin sidonnan, jossa muodostuu 4-hiilinen yhdiste, oksaloasetaatti, joka muunnetaan C4-hapoiksi, kuten malaatiksi, jotka kuljetetaan BSC:iin, mikä mahdollistaa hiilidioksidin tehokkaan assimilaation hiilihydraateiksi Calvinin syklin avulla BSC:ssä. Toisin kuin C3-kasveissa, C4-kasvien BSC:llä on siis fotosynteettisiä toimintoja, kuten C4-yhdisteen dekarboksylaatio ja Calvinin syklin prosessi. Näiden prosessien suorittamiseksi C4-kasvien BSC:t ovat suurentuneet ja niissä on enemmän kloroplastia, mikä tekee BSC:istä voimakkaampia ja fotosynteettisesti aktiivisempia. C3-lajien BSC:t tasapainottavat hydraulista painetta, estävät ilman pääsyn solujenvälisistä tiloista ksyleemiin, muodostavat vesivaraston, joka puskuroi transpiraatiosta johtuvia häviöitä, ja mahdollistavat suoniin osuvan valon suuremman intensiteetin pääsyn ja hajottamisen lehteen (Nikolopoulos ym. 2002). C3-kasvien BSC:n muita tehtäviä ovat typen, rikin ja hiilihydraattien kuljetus sekä rooli signaalireitillä, jota on tarkasteltu laajasti (Leegood 2008). C4-lajeissa BSC:t ja MC:t tekevät yhteistyötä kaksivaiheisessa fotosynteesissä. BSC:n ja MC:n välisen suoran yhteyden varmistamiseksi C4-kasveilla on erityinen lehtien anatomia, johon liittyy kloroplastien lisääntyminen BSC:ssä. Jotta C4-reitti voitaisiin ottaa käyttöön riisissä, BSC:ssä tarvitaan enemmän fotosynteettisiä kloroplasteja kuin riisillä nyt on. Tämä voitaisiin toteuttaa ilmentämällä kloroplastien kehittymisen kannalta välttämättömiä geneettisiä elementtejä, kuten Golden2:n kaltaisia (GLK) geenejä, solukohtaisesti käyttämällä C4-geenien promoottoreita, kuten Zea mays -lajin fosfoenolipyruvaattikarboksylaasia (PEPC) MC-spesifiseen ilmentymiseen ja Zoysia japonica -lajin fosfoenolipyruvaattikarboksykinaasin (PCK) promoottoria BSC-spesifiseen ilmentymiseen riisinlehdillä (Matsuoka et al., ). 1994; Nomura ym. 2005).
Anatomiset erot C3- ja C4-lehtien välillä. (A) C3-lehti (Oryza sativa L., riisilajike IR64) ja (B) C4-lehti (Setaria viridis). Riisin mesofyllisolu (MC) on täynnä kloroplastia, joka on yli 90 % kloroplastien kokonaismäärästä, kun taas nipun vaippasoluissa (BSC) on hyvin vähän kloroplastia, joka on alle 10 % riisin lehtien kloroplastien kokonaismäärästä. C4-lajin lehdissä kloroplastit sijaitsevat sekä BSC:ssä että MC:ssä.
Golden2-like (GLK) -geeniperheen jäsenet koodaavat ydinperäisiä transkriptiotekijöitä, joiden on arveltu säätelevän kloroplastien kehitystä Arabidopsiksessa, Zea maysissa ja sammalessa Physcomitrella patensissa (Rossini ym. 2001). Kussakin näistä lajeista GLK-geenit muodostavat homologisen parin, jonka nimet ovat GLK1 ja GLK2 (Waters ym. 2009). Sammalissa ja Arabidopsiksessa GLK-geenit ovat redundantteja ja toiminnallisesti samanarvoisia, kun taas maississa ja durrassa GLK-geenit toimivat solutyyppispesifisesti ohjaten dimorfisten kloroplastien kehitystä (Waters ym. 2008; Wang ym. 2013a). Maississa Golden2:n (G2) ja sen homologin ZmGLK1:n transkriptit kumuloituvat ensisijaisesti BS- ja M-soluihin, mikä viittaa siihen, että kullakin geenillä on erityinen rooli dimorfisten kloroplastien erilaistumisen säätelijänä (Wang ym. 2013a).
Vähentää suonivälejä ja kasvattaa siten suonitiheyttä lehdessä
C3- lajeissa fotosynteesi tapahtuu MC:ssä. Suuri määrä MC:itä peräkkäisten suonien välissä (kuva 1A) työntää suonet kauas toisistaan, jolloin suoniväli kasvaa tai suonitiheys pienenee. Riisin lehdissä on alle 6 suonta millimetriä kohti (kuva 2A), Setaria viridis ja durra (molemmat tyypillisiä C4-lajeja) ovat yli 7 suonta millimetriä kohti (kuvat 2B ja C). C4-lehdissä on keskimäärin 2 MC:tä suonten välissä (kuva 1B). C4-kasvien lehtien suurempi suonitiheys johtaa siihen, että M- ja BS-kudosten tilavuuksien suhde on lähes yksi yhteen. C4-lehden sisäinen anatomia muodostuu usein toistuvasta suoni-BS-M-M-M-BS-suoni-kuvioista. MC:n ympäröimät BSC:t muodostavat seppeleen kaltaisen rakenteen; saksalainen kasvitieteilijä G. Haberlandt kutsui tällaista lehden anatomiaa ”Kranzin anatomiaksi”. C4 BSC:llä on tiheä sytoplasma, ja se on täynnä suuria määriä kloroplasteja (kuva 1B). C4-reitin tehokkaan toiminnan kannalta on välttämätöntä, että M- ja BS-solut ovat tiiviisti yhteydessä toisiinsa, ja nämä solut ovat tiiviisti yhteydessä toisiinsa suurella määrällä plasmodesmoja Dengler ja (Nelson 1999). Kranzin anatomiaa esiintyy vähäisin variaatioin lähes kaikissa yksisoluisissa ja kaksisoluisissa sukulinjoissa, jotka käyttävät C4-fotosynteesireitin kaksisoluista tapaa. Lehtien anatomiaa ja morfologiaa koskevissa tutkimuksissa on löydetty useita geenejä, jotka vastaavat lehtien solujen kasvusta, kehityksestä tai epämuodostumista. Geeni ACAULIS1 oli vastuussa lehtien solujen pidentymisestä (Tsukaya ym. 1993). CURLEY LEAF (CLF) -geenin mutaatio tuotti kaarevia lehtiä Arabidopsiksessa (Kim ym. 1998). Rotunda 1 (RON1) -geenin (Robles ym. 2010) aiheuttama vapaiden suonten päättymisen lisääntyminen, avoin suonikuvio ja pyöreä lehtirakenne. Scarecrow-geenin mutaatio maississa osoitti BSC:n määrän lisääntymistä, BS-kloroplastin epätavallista erilaistumista, pienten suonien vähenemistä ja suonitiheyden muuttumista (Slewinski ym. 2012). Nämä tutkimukset, jotka liittyvät tiettyjen geenien mutaation aiheuttamaan epänormaaliin suonikuviointiin, antavat viitteitä siitä, miten Kranzin anatomiaa säädellään, ja viittaavat siihen, että Kranzin kuvion kehittymisessä on mukana useita reittejä. SCARECROW/SHORTROOT-säätelyverkoston on todettu olevan yksi tärkeistä Kranzin anatomian kuvioinnissa tarvittavista komponenteista, koska sellaisten C3-kasvien lehdet, joissa Scarecrow-geeni oli mutatoitunut, olivat normaalit, kun taas C4-kasveissa saman geenin mutaatio vaurioitti Kranzin anatomiaa (Slewinski ym. 2012; Wang ym. 2013b). Äskettäin on osoitettu, että maissin kromosomien tuominen kauraan saattoi kasvattaa BSC:n kokoa ja pienentää suoniväliä C3-kauran lehdissä, mikä osoittaa, että C3-lehden anatomiaa voidaan muuttaa (Tolley ym. 2012). Lisäksi on tehty paljon työtä seulomalla durran (C4) mutantteja, joilla suoniväli on kasvanut, ja riisin (C3) mutantteja, joilla suoniväli on pienentynyt, jotta suoniväli-ominaisuutta kontrolloivat geenit voitaisiin tunnistaa (Rizal ym. 2012).
Lehtien suonitiheyksien vaihtelu C3- ja C4- kasvien välillä. Suonitiheys (A) C3- (Oryza sativa L., riisilajike IR64), (B) C4- (Setaria viridis) ja (C) C4- (Sorghum bicolor) lehtileikkeissä. Riisin suonitiheys on alhainen verrattuna C4-kasveihin, kuten S. viridis ja durra.
Calvinin syklin aktiivisuuden pitäisi vähentyä merkittävästi MC:ssä ja lisääntyä huomattavasti riisin BSC:ssä
C4-fotosynteesille on ominaista biokemiallinen hiilidioksidin pumppausmekanismi, joka nostaa hiilidioksidikonsentraatiota Rubiscon sijaintipaikalla. Korkea CO2-pitoisuus Rubiscon ympärillä vähentää fotorespiraation nopeutta ja lisää netto- CO2-assimilaatiota, mikä johtaa erittäin tehokkaaseen fotosynteesiin Weber ja von (Caemmerer 2010). Tämän saavuttamiseksi CO2-assimilaatio C4:ssä jakautuu kahteen solutyyppiin, MC- ja BSC-soluihin (kuva 3). Siksi C4:n hiilensidonta riippuu solukohtaisesta geeniekspressiosta ja lokalisaatiosta. Viereiset fotosynteettisesti aktiiviset BS- ja M-solut ovat vuorovaikutuksessa Rubisco-katalysoidun O2-fiksaation eliminoimiseksi. Kaksisoluisissa C4-kasveissa hiilidioksidi kiinnittyy ensin MC-soluissa oksaloasetaatiksi kutsutuksi C4-hapoksi O2-herkän karboksylaasin, fosfoenolipyruvaattikarboksylaasin (PEPC, EC 4.1.1.31), avulla. Oksaloasetaatti muunnetaan sitten malaatiksi tai aspartaatiksi ja kuljetetaan BSC:iin, jossa se dekarboksyloituu ja CO2 vapautuu. Rubisco sitoo CO2:n uudelleen, ja kaikki Calvinin syklin myöhemmät toiminnot tapahtuvat BSC:n kloroplastissa (Nelson ja Langdale 1989). Näin ollen toimivan C4-riisin aikaansaamiseksi Rubiscon aktiivisuutta on vähennettävä huomattavasti MC:ssä ja lisättävä BSC:ssä, jolloin Calvinin sykli rajoittuu riisin BSC:iin, kuten C4-järjestelmässä. Toisaalta tiettyjen C4-entsyymejä, kuten β-karbonianhydraasia (CA) ja PEPC:tä, koodaavien geenien on ilmentynyt liikaa riisin MC:n sytosolissa, jotta primaarinen hiilidioksidin kiinnittyminen helpottuisi, jotta hiilidioksidi voidaan konsentroida ja syöttää Rubiscolle BSC:ssä. C4-sykliin kuuluu myös laaja metaboliittien kuljetus kloroplastin kotelokalvon ja MC:n ja BSC:n plasmalemman läpi (kuva 3). Näin ollen C4:n ydinentsyymien eli CA:n, PEPC:n, pyruvaattiortofosfaatti (Pi)-dikinaasin (PPDK, EC 2.7.9.1), NADP-riippuvaisen malaattidehydrogenaasin (NADP-MDH, EC 1.1.1.1.82) ja NADP-riippuvaisen omenahappoentsyymin (NADP-ME, EC 1.1.1.1.40), C4-reitti edellyttää myös oksaloasetaatin, malaatin, trioosifosfaatin ja pyruvaatin aineenvaihduntatuotteiden kuljettajien lisäämistä riisiin, jotta C4-syklin välituotteiden kuljetuskapasiteettia voidaan lisätä, jotta Calvinin sykli voi toimia tehokkaasti BSC:ssä (Weber ja von Caemmerer 2010).
Yksinkertaistettu biokemiallinen reitti C4-fotosynteesin NADP-ME-alatyypille, jota C4-riisikonsortio kehittää geneettisesti indica-riisilajikkeeseen. PEPC tekee ensimmäisen karboksylaation MC:ssä tuottaen oksaloasetaattia, jonka MDH muuntaa edelleen malaatiksi. Tämä C4-happo kuljetetaan MC:stä BSC-kloroplastiin, jossa NADP-ME dekarboksyloi sen pyruvaatiksi ja CO2 vapautuu Rubiscolle Calvinin syklin reaktioiden suorittamista varten. C4-riisissä Rubiscon pitäisi ilmentyä BSC:ssä, ja näin ollen kohonnut hiilidioksidipitoisuus sen sijaintipaikassa vähentää sen hapetusaktiivisuutta, mikä puolestaan vähentää fotorespiraatiota. 3-PGA: 3-fosfoglykaraatti, CA: Hiilihappoanhydraasi, DiT1: Dikarboksylaattitranslokaattori1, DiT2: Dikarboksylaattitranslokaattori2, MEP: Mesofyllin kuoriproteiini, NADP-MDH: NADP-malaattidehydrogenaasi, NADP-ME: NADP-maliini-entsyymi, NADP-ME: NADP-maliini-entsyymi, NADP-ME: NADP-maliini-entsyymi, NADP-ME: NADP-maliini-entsyymi: Oxaloacetate, OMT: Oxoglutarate/malate translocator, PEPC: Fosfoenolipyruvaattikarboksylaasi, PPDK: pyruvaatti-ortofosfaatti (Pi) dikinaasi, PPT: Fosfoenoli-pyruvaattifosfaattitranslokaattori, Rubisco: Ribuloosi-1,5-bisfosfaattikarboksylaasi/oksygenaasi, RuBP: Ribuloosi-1,5-bisfosfaatti ja TPT: Trioosifosfaattifosfaattitranslokaattori.
Fotorespiraatio mesofyllisoluissa on vähennettävä huomattavasti
C3-kasveissa hiilen sidonta ja Calvinin kierto tapahtuvat MC-soluissa. Hiilen sidonnassa ribuloosa-1,5-bisfosfaatti (RuBP) – viiden hiilen yhdiste, jota katalysoi entsyymi ribuloosa-1,5-bisfosfaattikarboksylaasi-oksylaasi (Rubisco, EC.4.1.1.39) reagoi hiilidioksidin kanssa muodostaen kaksi molekyyliä kolmihiilistä yhdistettä, jota kutsutaan 3-fosfoglyseraatiksi (3-PGA). Calvinin syklissä kaksi PGA-molekyyliä muodostavat energiarikkaan sokerimolekyylin (trioosifosfaatti) ja uudistavat RuBP:tä seuraavaa sykliä varten. Nykyisillä ilmakehän hiilidioksidipitoisuuksilla (noin 400 ppm) Rubisco katalysoi myös RuBP:n ja O2:n välistä reaktiota, jonka tuloksena syntyy yksi molekyyli 2-fosfoglykolaattia ja 3-PGA:ta (Peterhansel ja Maurino 2011). 2-fosfoglykolaatti on muunnettava takaisin 3-PGA:ksi fotorespiraatioksi kutsutussa prosessissa, johon kuuluu sarja biokemiallisia reaktioita. Tämän prosessin aikana menetetään aiemmin sidottua hiiltä ja typpeä, ja lisäksi on käytettävä ylimääräistä energiaa (Sharpe ja Offermann 2013).
C4-kasvit ovat kehittäneet mekanismeja, joilla rajoitetaan Rubiscon lokalisaatiota ja toimintaa BSC:ssä. MC:t estävät spatiaalisesti BSC:ssä olevan Rubiscon ja solujen välisissä tiloissa olevan O2:n välisen kosketuksen, mikä estää energian häviämisen fotorespiraation kautta. C4-kasvien fotorespiraation eliminoimisesta on osoituksena niiden hyvin alhainen CO2-kompensaatiopiste, joka on lähes nolla, ja jatkuvasti korkea karboksylaatiotehokkuus (CE) ilman, että ne reagoivat O2-pitoisuuksien muutoksiin (kuva 4). Sitä vastoin C3-kasveilla O2-pitoisuuden muuttuessa 21 prosentista 2 prosenttiin kompensaatiopiste laski merkittävästi 55 ppm:stä 30 ppm:ään (taulukko 1). Kuvassa 4 CE laskettiin (Li et al. 2009) mukaisesti, mikä osoitti, että durran CE ei muuttunut merkittävästi O2-pitoisuuden muuttuessa, mutta riisin CE parani erittäin merkittävästi, kun O2-pitoisuus laski 21 prosentista 2 prosenttiin (kuva 4 ja taulukko 1). CE:n kasvu durrassa oli vain 6,1 %, kun taas riisissä se oli 41,5 %, kun solujen välinen O2-pitoisuus laski 2 %:iin (taulukko 1). Nämä tiedot osoittavat, että riisin fotosynteettistä kapasiteettia on mahdollista lisätä vähentämällä fotorespiraatiota, mikä puolestaan lisäisi satoa huomattavasti. Yksi tapa vähentää fotorespiraatiota MC:ssä on vähentää glysiinidekarboksylaasi (GDC) -proteiinin määrää MC:ssä ja rajoittaa sen kertymistä BSC:hen siten, että glysiinin dekarboksylaatio tapahtuu yksinomaan BSC:ssä, jolloin BSC:ssä syntyy korkeampi hiilidioksidikonsentraatio, joka on samankaltainen kuin C3-C4-väliaineissa (Monson ja Rawsthorne 2000). C4-riisin konsortio testaa tätä lähestymistapaa käyttämällä keinotekoista mikroRNA:ta, joka on suunniteltu riisin GDC-H-alayksikköä vastaan ja jota ohjaa ZmPEPC-promoottori (Kajala ym. 2011). Tällainen biokemiallinen mekanismi edellyttää BSC:n solujen erikoistumista, johon kuuluu kloroplastien ja mitokondrioiden lukumäärän lisääntyminen, mikä rikastuttaa riisin BSC:n organellipitoisuutta ja auttaa GDC:n glysiinin dekarboksylaatiosta vapautuvan hiilidioksidin talteenotossa (Ueno 2011). Toinen lähestymistapa, jolla onnistuttiin vangitsemaan fotorespiraatiosta vapautuva hiilidioksidi fotosynteesin tapahtumapaikalle, on Escherichia coli -bakteerin glykolaattikatabolisen reitin siirtäminen Arabidopsis thalianan kloroplasteihin, joissa kloroplasteissa oleva glykolaatti muunnettiin suoraan glyseraatiksi (Kebeish et al. 2007). Tätä strategiaa, jolla vähennettiin fotorespiraatiota ja tehostettiin fotosynteesiä Arabidopsiksessa ja johon sisältyi asteittainen ydintransformaatio viidellä kloroplastiin kohdistetulla bakteerigeenillä, jotka koodaavat glykolaattidehydrogenaasia, glyoksylaattikarboligaasia ja tartronisemialdehydireduktaasia, voitaisiin soveltaa muihin C3-kasveihin, kuten riisiin, mutta bakteerigeenien käyttö ei ehkä ole suositeltava vaihtoehto C4-lajin riisin kehittämisessä.
Fotosynteesin nopeus C3- ja C4-lajissa kahdella eri (21 % ja 2 % ) O 2 -tasolla. Fotosynteesinopeus eli CO2-assimilaationopeus (A) mitattiin solujen välisellä CO2-pitoisuudella 0, 20, 50, 100 ja 200 μmol mol-1 muutettuna kolmen minuutin välein. Lohkon ja lehden lämpötila oli 28 ± 1 °C, suhteellinen kosteus 68 ± 5 %, valon intensiteetti 1500 μmol m-2 s-1 ja virtausnopeus 400 μmol s-1.
C4-polun suunnittelu riisiin
Ajateltiin, että yksisoluinen C4-järjestelmä olisi nopeampi asentaa C3- kasveihin. Yksisoluista C4-fotosynteesijärjestelmää on yritetty kehittää myös riisiin (Miyao ym. 2011). Jotta voitaisiin ottaa käyttöön yksisoluinen C4:n kaltainen reitti, jossa MC:llä saadaan hiilidioksidi sidottua ja vapautettua Hydrilla verticillata (L.f) Roylessa tapahtuvalla tavalla, neljää reittiin osallistuvaa entsyymiä (PEPC, PPDK, NADP-MDH ja NADP-ME) ylituotettiin siirtogeenisissä riisin lehdissä (Ku ym. 1999; Fukayama ym. 2001; Tsuchida ym. 2001; Taniguchi ym. 2008). Muutamia tärkeimpiä ongelmia, jotka on ratkaistava, jotta yhden solun C4:n kaltainen reitti voidaan toteuttaa riisissä, ovat: mekanismi, jolla helpotetaan PEP:n kuljetusaktiivisuutta kloroplastin kuoren läpi, OAA:n tuonti kloroplastiin ja NADP-ME-reaktion suunta, NADP-MDH:n osallistuminen, endogeenisen PEPC:n läsnäolo riisin MC-kloroplastin sisällä ja NADP-MDH:n aktiivisuuden lisääminen edelleen, kuten raportoitiin, ovat välttämättömiä (Miyao et al. 2011). Chenopodiaceae-heimoon kuuluvat terrestriset yksisoluiset C4-lajit, kuten Bienertia cycloptera, B. sinuspersici ja Suaeda aralocaspica, tarvitsevat myös hiilen assimilaation ja dekarboksylaation alueellista lokerointia (Chuong et al. 2006). Näillä lajeilla on dimorfiset kloroplastit näissä lokeroissa. Aikaisemmat yritykset tuottivat tuloksettoman syklin, mikä johtui siitä, että anatomia ei muuttunut, sopivia siirtäjiä ei ollut, ja riisiin muunnetut maissigeenit eivät ilmentyneet asianmukaisesti solukohtaisesti eivätkä niitä säädelty kuten maississa, vaan niitä säädeltiin kuten riisin endogeenisiä C3-isoformeja (Miyao et al., ). 2011).
Suuntaamaan fotosynteesireittiä C3:sta C4:ksi kahdessa vuosikymmenessä, mikä luonnossa kesti miljoonia vuosia, C4-riisin konsortio aloitti samanaikaisen geenien löytämisen ja jo tunnettujen geenien muuntamisen riisiin tavoitteenaan muodostaa C4-riisi, jolla on Kranzin tyyppinen anatomia. C4-geenit, kuten CA, PEPC, PPDK, NADP-ME ja NADP-MDH, kloonataan maissista ja muunnetaan riisiin. Myös C4-aineenvaihduntareiteillä yliekspressoituneet kuljettajat, kuten 2-oksoglutaraatti/malaattikuljettaja (OMT1), dikarboksylaattikuljettaja1 (DiT1), dikarboksylaattikuljettaja2 (DiT2), PEP/fosfaattikuljettaja (PPT1), mesofyllien kuoriproteiini (MEP) ja trioosifosfaattifosfaattitranslokaattori (TPT), jotka tunnistettiin hiljattain maissin BS- ja MS- ja BS-rasvahapposoluista tehdyssä proteomiikan analyysissä, on tunnistettu riisin geeniperimän perusteella (Friso et al. 2010) muunnetaan riisiin (kuva 3). C4-riisin konsortion jäsenet ovat myös mukana löytämässä uusia Kranzin anatomiaan liittyviä geenejä (Wang ym. 2013b). Kun lupaavat Kranzin anatomiaa kontrolloivat ehdokasgeenit on testattu, ne sisällytetään myös riisikasveihin, jotka on muunnettu C4-biokemiallisen reitin geeneillä.