Come JAK3 è espressa nelle cellule ematopoietiche ed epiteliali, il suo ruolo nella segnalazione delle citochine si pensa sia più ristretto rispetto alle altre JAK. È più comunemente espressa nelle cellule T e nelle cellule NK, ma è stata trovata anche nelle cellule epiteliali intestinali. JAK3 è coinvolta nella trasduzione del segnale da parte dei recettori che utilizzano la catena gamma comune (γc) della famiglia dei recettori delle citochine di tipo I (ad esempio IL-2R, IL-4R, IL-7R, IL-9R, IL-15R e IL-21R). Le mutazioni che abrogano la funzione di Janus kinase 3 causano una SCID autosomica (grave malattia da immunodeficienza combinata), mentre le mutazioni che attivano Janus kinase 3 portano allo sviluppo della leucemia.
In aggiunta ai suoi ben noti ruoli nelle cellule T e NK, JAK3 è stata trovata per mediare la stimolazione di IL-8 nei neutrofili umani. IL-8 funziona principalmente per indurre la chemiotassi nei neutrofili e nei linfociti, e il silenziamento di JAK3 inibisce gravemente la chemiotassi mediata da IL-8.
Cellule epiteliali intestinaliModifica
Jak3 interagisce con la proteina villina legata all’actina, facilitando così il rimodellamento citoscheletrico e la riparazione delle ferite della mucosa. Determinanti strutturali che regolano le interazioni tra Jak3 e proteine citoscheletriche della famiglia villina / gelsolina sono stati caratterizzati. La ricostituzione funzionale dell’attività chinasica da parte di Jak3 ricombinante utilizzando Jak3-wt o villina/gelsolina-wt come substrato ha dimostrato che l’autofosforilazione di Jak3 era il passo limitante durante le interazioni tra Jak3 e le proteine citoscheletriche. I parametri cinetici hanno mostrato che Jak3 fosforilato (P) si lega a P-villina con una costante di dissociazione (Kd) di 23 nM e un coefficiente di Hill di 3,7. Il legame a coppie tra i mutanti di Jak3 e la villina ha mostrato che il dominio FERM di Jak3 era sufficiente per legarsi alla P-villina con una Kd di 40,0 nM. Tuttavia, il dominio SH2 di Jak3 ha impedito a P-villina di legarsi al dominio FERM della proteina non fosforilata. L’interazione intramolecolare tra i domini FERM e SH2 di Jak3 non fosforilato ha impedito a Jak3 di legarsi alla villina e l’autofosforilazione della tirosina di Jak3 al dominio SH2 ha diminuito queste interazioni intramolecolari e facilitato il legame del dominio FERM alla villina. Questi dimostrano il meccanismo molecolare delle interazioni tra Jak3 e le proteine citoscheletriche in cui la fosforilazione della tirosina del dominio SH2 ha agito come un interruttore intramolecolare per le interazioni tra Jak3 e le proteine citoscheletriche.
I danni sostenuti al rivestimento della mucosa nei pazienti con malattie infiammatorie intestinali (IBD) facilitano la traslocazione dei microbi intestinali alle cellule immunitarie sottomucose portando all’infiammazione cronica. IL-2 svolge un ruolo nell’omeostasi delle cellule epiteliali intestinali (IEC) attraverso la regolazione concentrazione-dipendente della proliferazione e della morte cellulare IEC. L’attivazione da parte di IL-2 ha portato a interazioni tirosina-fosforilazione-dipendenti tra Jak3 e p52ShcA solo a basse concentrazioni. Concentrazioni più elevate di IL-2 hanno diminuito la fosforilazione di Jak3, interrotto le sue interazioni con p52ShcA, ridistribuito Jak3 al nucleo e indotto l’apoptosi in IEC. IL-2 ha anche indotto una downregulation dose-dipendente di jak3-mRNA. Studi di sovraespressione costitutiva e di abbattimento mediato da mir-shRNA hanno dimostrato che l’espressione di Jak3 era necessaria per la proliferazione indotta da IL-2 di IEC. Inoltre, la downregulation indotta da IL-2 di jak3-mRNA era responsabile di una maggiore apoptosi indotta da IL-2 in IEC. Così l’omeostasi della mucosa indotta da IL-2 attraverso la regolazione post-traslazionale e trascrizionale di Jak3.
Jak3 è anche implicato nella differenziazione della mucosa e nella predisposizione alle malattie infiammatorie intestinali nel modello dei topi. Questi studi dimostrano che Jak3 è espresso nella mucosa colonica dei topi, e la perdita di espressione mucosale di Jak3 si traduce in una ridotta espressione di marcatori di differenziazione per le cellule di entrambi i lineages enterocitari e secretori. I topi Jak3 KO hanno mostrato una ridotta espressione della villina colonica, dell’anidrasi carbonica, della mucina secretoria muc2, e un’aumentata infiammazione colonica basale riflessa da un aumento dei livelli di citochine pro-infiammatorie IL-6 e IL-17A nel colon insieme a una maggiore attività mieloperossidasi del colon. Le infiammazioni nei topi KO sono state associate all’accorciamento della lunghezza del colon, alla riduzione della lunghezza del cieco, alla diminuzione dell’altezza delle cripte e all’aumento della gravità della colite indotta dal destrano solfato di sodio. Nelle cellule epiteliali coloniche umane differenziate, Jak3 si è ridistribuito sulle superfici basolaterali e ha interagito con la proteina β-catenina della giunzione adherens (AJ). L’espressione di Jak3 in queste cellule era essenziale per la localizzazione AJ di β-catenina e il mantenimento delle funzioni di barriera epiteliale. Collettivamente, questi risultati dimostrano il ruolo essenziale di Jak3 nel colon dove ha facilitato la differenziazione della mucosa promuovendo l’espressione dei marcatori di differenziazione e migliorato le funzioni di barriera del colon attraverso la localizzazione AJ della β-catenina.
Sebbene l’attivazione costitutiva di Janus kinase 3 (Jak3) porti a diversi tipi di cancro, il meccanismo di regolazione trans-molecolare dell’attivazione di Jak3 è riportato solo recentemente. Questo studio ha dimostrato che l’autofosforilazione di Jak3 era il passo limitante durante la trans-fosforilazione di Jak3 di Shc, dove Jak3 ha fosforilato direttamente (P) due residui di tirosina nel dominio SH-2, e un residuo di tirosina ciascuno nei domini CH-1 e PID di Shc. Le interazioni dirette tra i mutanti di Jak3 e Shc hanno mostrato che mentre il dominio FERM di Jak3 era sufficiente per legarsi a Shc, i domini CH-1 e PID di Shc erano responsabili del legame con Jak3. Funzionalmente, Jak3 era auto-fosforilato sotto la stimolazione di IL-2 nelle cellule epiteliali. Tuttavia, Shc ha reclutato la tirosina fosfatasi SHP-2 e PTP-1B a Jak3 e quindi ha defosforilato Jak3. Così lo studio non solo ha caratterizzato l’interazione di Jak3 con Shc, ma ha anche dimostrato il meccanismo di regolazione intracellulare dell’attivazione di Jak3 in cui le interazioni di Jak3 con Shc hanno agito come regolatore della defosforilazione di Jak3 attraverso interazioni dirette di Shc sia con Jak3 che con le fosfatasi tirosiniche.
L’infiammazione cronica di basso grado (CLGI) gioca un ruolo chiave nel deterioramento metabolico nella popolazione obesa. L’espressione e l’attivazione di Jak3 forniscono una protezione contro lo sviluppo di CLGI e le complicazioni di salute associate. Studi su modelli di roditori mostrano che la perdita di Jak3 provoca un aumento del peso corporeo, CLGI sistemica basale, omeostasi glicemica compromessa, iperinsulinemia e sintomi precoci di steatosi epatica. La mancanza di Jak3 si traduce anche in sintomi esagerati di sindrome metabolica da dieta occidentale ad alto contenuto di grassi. Meccanicamente, è dimostrato che Jak3 è essenziale per l’espressione ridotta e l’attivazione di toll like receptors (TLRs) nella mucosa intestinale murina e nelle cellule epiteliali intestinali umane dove Jak3 ha interagito con e attivato p85, la subunità di regolazione della PI3K, attraverso la fosforilazione della tirosina della proteina adattatore substrato del recettore dell’insulina (IRS1). Queste interazioni hanno portato all’attivazione dell’asse PI3K-Akt, essenziale per la riduzione dell’espressione di TLR e l’attivazione di NF-κB associata a TLR. Nel complesso, Jak3 svolge un ruolo essenziale nella promozione della tolleranza mucosale attraverso l’espressione soppressa e l’attivazione limitata dei TLR, prevenendo così la CLGI intestinale e sistemica e l’obesità associata e la MetS.
La compromissione delle giunzioni di aderenza (AJ) è associata a diverse malattie infiammatorie croniche. La caratterizzazione funzionale ha mostrato che l’autofosforilazione di Jak3 era il passo limitante durante la trans-fosforilazione di Jak3 di β-catenina, dove Jak3 fosforila direttamente tre residui di tirosina, cioè Tyr30, Tyr64 e Tyr86 nel dominio N-terminale (NTD) di β-catenina. Tuttavia, la fosforilazione preliminare di β-catenina a Tyr654 era essenziale per l’ulteriore fosforilazione di β-catenina da parte di Jak3. Gli studi di interazione hanno indicato che Jak3 fosforilato si è legato alla β-catenina fosforilata con una costante di dissociazione di 0,28 μm, e anche se sia la chinasi che i domini FERM (Banda 4.1, ezrin, radixina e moesina) di Jak3 hanno interagito con la β-catenina, il dominio NTD della β-catenina ha facilitato le sue interazioni con Jak3. Fisiologicamente, la fosforilazione mediata da Jak3 di β-catenina ha soppresso la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) mediata da EGF e ha facilitato le funzioni di barriera epiteliale tramite la localizzazione AJ di β-catenina fosforilata attraverso le sue interazioni con α-catenina. Inoltre, la perdita di Jak3-mediata siti di fosforilazione in β-catenina abrogato la sua localizzazione AJ e compromesso le funzioni di barriera epiteliale. Insieme, questo studio non solo ha caratterizzato l’interazione di Jak3 con la β-catenina, ma ha anche dimostrato il meccanismo di interazione molecolare tra le dinamiche AJ e EMT attraverso la fosforilazione NTD mediata da Jak3 della β-catenina.
La proteina di resistenza del cancro al seno (BCRP) è un membro delle proteine trasportatrici ATP-binding cassette (ABC) la cui funzione primaria è di effluire substrati legati alla membrana plasmatica. Le funzioni della barriera intestinale compromesse giocano un ruolo importante nell’obesità associata all’infiammazione cronica di basso grado (CLGI), ma la regolazione di BCRP durante l’obesità e il suo ruolo nel mantenere la funzione della barriera intestinale durante l’obesità associata a CLGI erano sconosciuti. Utilizzando diversi approcci, tra cui saggi di efflusso, immunoprecipitazione/blotting/istochimica, saggio di permeabilità paracellulare, selezione cellulare attivata da fluorescenza, saggio delle citochine e microscopia a immunofluorescenza, studi recenti suggeriscono che gli individui obesi hanno funzioni BCRP intestinali compromesse e che i topi obesi indotti dalla dieta ricapitolano questi risultati. È stato anche dimostrato che le funzioni BCRP compromesse durante l’obesità sono dovute alla perdita della fosforilazione della tirosina mediata da Janus kinase 3 (JAK3) di BCRP. I risultati degli studi hanno indicato che la fosforilazione mediata da JAK3 di BCRP promuove le sue interazioni con la β-catenina localizzata in membrana, essenziale non solo per l’espressione e la localizzazione superficiale di BCRP, ma anche per il mantenimento dell’efflusso di farmaci intestinali mediato da BCRP e delle funzioni di barriera. È stato osservato che la ridotta espressione intestinale di JAK3 durante l’obesità umana o il knockout di JAK3 nel topo o il knockdown di β-catenina mediato da siRNA nelle cellule epiteliali intestinali umane, risultano tutti in una perdita significativa dell’espressione intestinale di BCRP e nel compromesso dell’efflusso di farmaci e delle funzioni di barriera del colon. Questi risultati scoprono un meccanismo di BCRP-mediata efflusso di droga intestinale e funzioni di barriera e stabilire un ruolo per BCRP nella prevenzione CLGI-associata obesità sia negli esseri umani e nei topi. Questi studi hanno implicazioni più ampie non solo nella nostra comprensione dei meccanismi fisiologici e fisiopatologici delle funzioni di barriera intestinale e delle malattie infiammatorie croniche associate a CLGI, ma anche nelle caratteristiche farmacocinetiche e farmacodinamiche di formulazioni di farmaci orali mediate da proteine.