Abstract
Obiettivo. Mentre il valore del Ki-67 è stato riconosciuto nel cancro al seno, esiste anche una controversia. L’obiettivo di questo studio è quello di mostrare il valore prognostico del Ki-67 in base all’espressione del recettore del progesterone (PgR) in pazienti che hanno il recettore degli estrogeni (ER-) positivo, il recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER2-) negativo nel cancro al seno precoce. Metodi. Sono state esaminate le cartelle di pazienti con carcinoma mammario invasivo non metastatico che sono state sottoposte a chirurgia presso un singolo istituto tra il 2009 e il 2012. L’end point primario era la sopravvivenza libera da recidiva (RFS), e l’end point secondario era la sopravvivenza globale (OS). Ki-67 e PgR sono stati valutati con immunoistochimica per il tumore dopo l’intervento. Risultati. Un totale di 1848 pazienti sono stati arruolati in questo studio. 223 (12%) pazienti avevano Ki-67 alto (≥10%), e 1625 (88%) avevano bassa espressione di Ki-67. RFS e OS significativamente peggiori sono stati osservati nell’alta vs. bassa espressione di Ki-67 solo quando il PgR era basso (<20%) ( e 0,005, rispettivamente, per RFS e OS). Non c’era una differenza significativa in RFS e OS secondo Ki-67 quando il PgR era alto ( e 0.076). La RFS di quattro gruppi secondo l’alta/bassa espressione di Ki-67 e PgR è stata confrontata. Il gruppo con bassa PgR e alta espressione di Ki-67 ha mostrato l’esito peggiore tra di loro (). In un’analisi multivariata, il Ki-67 alto era un fattore prognostico indipendente quando la PgR era bassa (HR 3,05; 95% CI 1,50-6,19; ). Conclusioni. Ki-67 aveva un valore come fattore prognostico solo sotto un basso livello di espressione di PgR nel cancro al seno precoce. PgR dovrebbe essere considerato nella valutazione della prognosi delle pazienti con cancro al seno usando Ki-67.
1. Introduzione
La prognosi delle pazienti con cancro al seno è molto variabile e dipende da diverse caratteristiche. I tumori al seno rappresentano un gruppo eterogeneo di tumori con differenze istopatologiche, immunoistochimiche (IHC) e genetiche. Le caratteristiche clinico-istopatologiche sono state a lungo utilizzate per stimare la prognosi e decidere i piani di trattamento. Sono stati sviluppati approcci surrogati che utilizzano test IHC ampiamente disponibili per il recettore degli estrogeni (ER), il recettore del progesterone (PgR), il recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER2) e Ki-67. Recentemente, le informazioni genomiche sono state integrate nella clinica per prevedere la prognosi del cancro al seno e decidere il trattamento sistemico. Tuttavia, a causa dei costi elevati e dei problemi tecnici, i test genetici potrebbero non essere disponibili in gran parte del mondo. Il ruolo dei biomarcatori è ancora importante per determinare se il paziente potrebbe beneficiare di un particolare trattamento.
L’aumento della proliferazione è un segno distintivo dei tumori maligni ed è un parametro essenziale per la previsione della risposta alla terapia. Ki-67 è un indice proliferativo rappresentativo. Molti studi hanno utilizzato Ki-67 come un marcatore predittivo indipendente per il trattamento con valore prognostico per l’esito clinico e la sopravvivenza libera da malattia e complessiva. Tuttavia, c’è anche una controversia sull’uso di Ki-67, con alcuni studi che suggeriscono che Ki-67 manca di valore prognostico.
Il consenso di San Gallo ha riconosciuto una distinzione tra tumore “luminal A-like” e “luminal B-like” e ha sostenuto il valore di Ki-67 per la robusta informazione prognostica che trasmette. Lo sviluppo dell’analisi multigene ha permesso definizioni più raffinate dei sottotipi di cancro al seno. Le pazienti con tumori luminali A basati su IHC nel gruppo PgR basso avevano una sopravvivenza libera da malattia significativamente più povera rispetto a quelle nel gruppo PgR alto. Uno studio precedente ha riportato che il 51,3% dei tumori IHC luminali A con espressione PgR ≤20% rientrava nella classificazione luminale B intrinseca, e che solo il 30,9% dei tumori IHC luminali B con espressione PgR >20% erano effettivamente tumori luminali B intrinseci. Quindi, la classificazione IHC basata su PgR dei sottotipi luminali usata clinicamente è alquanto imprecisa, e la combinazione di questa classificazione con l’espressione di Ki-67 potrebbe migliorare l’accuratezza diagnostica.
L’obiettivo di questo studio era di chiarire il valore prognostico indipendente della determinazione dell’espressione di Ki-67. A tal fine, abbiamo studiato la relazione tra i livelli di espressione di Ki-67 e PgR nella pratica clinica e correlato l’espressione di questi marcatori con le variabili clinicopatologiche.
2. Materiali e metodi
2.1. Popolazione dello studio
Sono state raccolte retrospettivamente le cartelle di 1848 pazienti con carcinoma mammario invasivo confermato patologicamente, sottoposte a intervento chirurgico presso il Dipartimento di chirurgia, Seoul National University Hospital (SNUH; Seoul, Corea del Sud), tra luglio 2009 e dicembre 2012. Sono state incluse pazienti con cancro al seno ER-positivo e HER2-negativo, indipendentemente dallo stato di PgR. Sono state escluse le pazienti con diagnosi di carcinoma in situ o metastasi a distanza alla diagnosi iniziale o che erano state precedentemente operate per il cancro al seno, così come quelle per le quali non erano disponibili dati su PgR o Ki-67. Non abbiamo escluso i pazienti sottoposti a terapia sistemica neoadiuvante. L’analisi IHC è stata eseguita dal tessuto utilizzando la core biopsy in una diagnosi. Se le informazioni dai tessuti iniziali erano insufficienti, abbiamo usato sezioni permanenti nei pazienti che non erano stati sottoposti a terapia sistemica neoadiuvante. Il tessuto bioptico è stato ottenuto da pazienti sottoposti a terapia sistemica neoadiuvante prima del trattamento. La popolazione dello studio comprendeva pazienti con una diagnosi di stadio da I a IIIC secondo il sistema di stadiazione patologica AJCC (American Joint Committee on Cancer, 8a edizione). Le recidive sono state divise in locoregionali e a distanza. La recidiva controlaterale non è stata inclusa tra le categorie di recidiva in questo studio. L’end point primario era la sopravvivenza libera da recidiva (RFS) in relazione allo stato di espressione di Ki-67 e PgR. Il periodo di follow-up corrispondeva all’intervallo dall’intervento chirurgico all’ultima data di visita in ospedale, indipendentemente dal reparto visitato. L’end point secondario era la sopravvivenza globale (OS). Per il follow-up, le cartelle cliniche elettroniche dei pazienti sono state esaminate fino a novembre 2015; i decessi sono stati registrati in base ai rapporti a partire da dicembre 2013. La RFS è stata classificata in quattro gruppi in base alle correlazioni con l’espressione di Ki-67 e PgR.
2.2. Procedura IHC
L’espressione di ER, PgR, HER2 e Ki-67 è stata determinata mediante IHC in blocchi di tessuto fissati in formalina e inclusi in paraffina. I livelli di espressione dei recettori ormonali, HER2 e Ki-67 sono stati valutati utilizzando la tecnica del complesso avidina-biotina. I tessuti sono stati tagliati in sezioni di 4 μm di spessore, deparaffinati con xilene, reidratati con una serie graduale di etanolo, e immersi in soluzione salina tamponata con Tris. Sezioni rappresentative sono stati immunostained, e più di 10 campi di vista ad alta potenza sono stati selezionati a caso ed esaminati al microscopio ottico. Dopo il recupero dell’antigene, le sezioni sono state incubate con anticorpi primari contro ER (1DO5; Dako, Danimarca; 1 : 50), PgR (PgR636; Dako; 1 : 50), HER2 (CB11; Novocastra Laboratories, upon-Tyne, UK; 1 : 200), e Ki-67 (MIB-1; Dako; 1 : 800) alle diluizioni indicate. Le sezioni sono state poi incubate con l’anticorpo secondario biotinilato anti-mouse e colorate con perossidasi di rafano streptavidina (Zymed Laboratories, San Francisco, CA, USA). Le sezioni sono state controcolorate con ematossilina di Mayer, disidratate, pulite e poi montate per l’esame. I campioni IHC sono stati analizzati da un patologo esperto al SNUH. Il valore di cutoff utilizzato per definire la bassa o alta espressione di Ki-67 era la presenza di immunoreattività Ki-67 in più del 10% dei nuclei colorati nei tessuti tumorali. Il cutoff del 10% per il Ki-67 è risultato avere il miglior valore predittivo per la prognosi al SNUH. I pazienti sono stati divisi in tumori con bassa (<20%) e alta (≥20%) espressione di PgR. Il cutoff di PgR del 20% è basato sulla Conferenza internazionale sul cancro al seno di San Gallo del 2013. Analisi statistica
Le pazienti sono state divise in gruppi Ki-67 bassi e alti e gruppi PgR bassi e alti. Le caratteristiche clinicopatologiche sono state valutate utilizzando tutti i confronti a coppie dei gruppi. Le variabili categoriche sono state confrontate usando il test chi-quadrato o il test esatto di Fisher. Il test t di Student è stato usato per confrontare le variabili continue tra due gruppi. La RFS è stata definita come l’intervallo dalla data dell’operazione alla data della prima osservazione di una recidiva o all’ultima data di follow-up senza evidenza di recidiva. La OS è stata definita come l’intervallo dalla data dell’operazione alla data del decesso o dell’ultimo follow-up. I tassi di sopravvivenza sono stati stimati utilizzando il metodo Kaplan-Meier, e le differenze tra due gruppi sono state confrontate utilizzando il test log-rank. Nelle analisi univariate e multivariate dei tassi di sopravvivenza, è stata utilizzata la regressione proporzionale di rischio di Cox con aggiustamento per vari fattori. Le analisi di regressione di Cox sono state utilizzate per calcolare gli hazard ratio (HR) e gli intervalli di confidenza (CI) al 95%. I valori erano a due facce e la significatività statistica era definita come un valore <0,05. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software SPSS, versione 21 per Windows (IBM Corp., Chicago, IL, USA).
3. Risultati
3.1. Caratteristiche clinicopatologiche dei pazienti
In questo studio sono stati arruolati 1.848 pazienti. Le caratteristiche clinicopatologiche dei pazienti analizzati sono state accessibili confrontando sottoinsiemi di espressione PgR bassi e alti e sottoinsiemi di Ki-67 bassi e alti. L’età media era di 49-52 anni in ogni sottogruppo. I tumori più grandi (>2 cm) erano più comunemente associati a Ki-67 alto () e PgR basso (). Il grado istologico (HG) dicotomizzava i campioni in sottogruppi bassi e alti, con il grado 3 classificato come alto e il grado 1 + 2 classificato come basso. I campioni nodopositivi e ad alto HG sono stati identificati anche in sottogruppi ad alto Ki-67 e basso PgR. Significativamente, più casi con PgR basso sono stati sottoposti a chemioterapia neoadiuvante, indipendentemente dallo stato Ki-67. Inoltre, più pazienti con alto Ki-67 sono stati sottoposti a chemioterapia adiuvante, indipendentemente dallo stato di PgR. Abbiamo anche considerato le caratteristiche del tumore secondo il metodo di intervento. Un totale di 719 pazienti sono state sottoposte a mastectomia, con un numero maggiore di queste pazienti con bassa espressione di PgR rispetto a quella alta. Tuttavia, non c’era alcuna associazione significativa tra i sottoinsiemi Ki-67 e la frequenza della mastectomia. Solo i sottoinsiemi PgR erano significativamente diversi tra i tipi di chirurgia dell’ascella. La recidiva, locale o a distanza, è stata osservata in 52 pazienti. La recidiva era locale in 10 casi e a distanza in 42 casi. I risultati della mortalità si basano su dati pubblici del Ministero dell’Interno; a partire dal 2013 (ultimo anno per il quale sono stati esaminati i dati di mortalità), 11 pazienti erano morti (tabella 1).
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PgR: recettore del progesterone, IDCa: carcinoma duttale invasivo, ILCa: carcinoma lobulare invasivo, e LN: linfonodo. Esiti dei pazienti secondo l’espressione di Ki-67 e PgR.
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RFS era significativamente migliore per i pazienti nel gruppo con bassa espressione di Ki-67 rispetto a quelli nel gruppo con alta espressione di Ki-67 (Figura 1(a)). La RFS era anche significativamente migliore per il gruppo di espressione PgR alta rispetto al gruppo di espressione PgR bassa (; Figura 1(b)).
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(b)
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Interessante, un’analisi del sottogruppo ha mostrato che la RFS basata sullo stato di espressione del Ki-67 era significativamente diversa nel sottogruppo a bassa PgR ma non in quello ad alta PgR. In particolare, la RFS dei pazienti con alta espressione di Ki-67 e bassa espressione di PgR (<20%) era peggiore di quella del gruppo con bassa espressione di Ki-67 e bassa espressione di PgR (; Figura 2(a)). Al contrario, tra i pazienti del gruppo con alta espressione PgR (≥20%), non c’era una differenza significativa tra i gruppi con alta e bassa espressione Ki-67 (; Figura 2(b)).
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(b)
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RFS è stato ulteriormente analizzato correlandolo con sottogruppi divisi in quattro gruppi in base all’espressione Ki-67 e PgR. I pazienti con bassa PgR e alta espressione Ki-67 hanno mostrato l’esito più povero rispetto agli altri tre gruppi (; Figura 3).
I modelli di regressione Cox multivariati hanno mostrato che il Ki-67 non era significativamente associato allo stato di alta espressione PgR, dopo aver aggiustato per i fattori tra cui il gruppo di espressione Ki-67, età, dimensioni del tumore, stato nodale e HG (HR 2.03; 95% CI 0.61-6.72; ; Tabella 2). Per i pazienti del sottogruppo PgR basso, Ki-67 era marcatamente associato a RFS (HR 3.05; 95% CI 1.50-6.19; ; Tabella 2). Le dimensioni del tumore erano statisticamente significative con RFS in entrambi gli stati PgR.
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Un’analisi dell’end point secondario, OS, ha mostrato analogamente una sopravvivenza superiore nel sottogruppo Ki-67 basso con bassa espressione PgR (; Figura 4(a)) e nessuna differenza significativa in OS tra sottogruppi Ki-67 nel gruppo PgR alto (; Figura 4(b)).
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I tempi medi di sopravvivenza libera da malattia erano 70 mesi nel sottogruppo basso PgR/alto Ki-67 e 75 mesi nel sottogruppo alto PgR/basso Ki-67. I tempi medi di sopravvivenza globale erano 74 mesi e 76 mesi, rispettivamente, per il sottogruppo basso PgR/alto Ki-67 e alto PgR/basso Ki-67.
4. Discussione
Qui abbiamo valutato il valore di Ki-67 come fattore prognostico indipendente per la recidiva e la sopravvivenza in pazienti con cancro al seno non metastatico con tumori ER-positivi e HER2-negativi. Coerentemente con i rapporti precedenti, il nostro studio ha dimostrato che l’espressione di Ki-67 aveva un valore prognostico significativo, ma abbiamo anche dimostrato che Ki-67 non è sempre un fattore prognostico indipendente. In particolare, Ki-67 aveva valore come fattore prognostico solo nel gruppo a bassa espressione di PgR. Nel nostro studio, un confronto di RFS tra i quattro sottogruppi di espressione ha rivelato la prognosi più sfavorevole nel sottogruppo a bassa espressione di PgR e alto Ki-67. E il sottogruppo era di 120 pazienti su 1848. Pertanto, il trattamento attivo può essere considerato in circa il 6% dei pazienti. In termini di previsione della prognosi, i nostri risultati suggeriscono che la combinazione del livello di espressione Ki-67 con il livello di espressione PgR migliora il valore predittivo. Allison et al. hanno riportato una forte correlazione tra alti Oncotype DX Recurrence Scores con espressione PR di grado 3 e basso-assente e Ki-67 > 10% . Inoltre, Thakur et al. hanno dimostrato che lo stato elevato di Ki-67 era significativamente correlato con il gruppo a più alto rischio di recidiva Oncotype DX (basso contro alto, ) . Se non è disponibile un’analisi genomica, la paziente con bassa espressione di PgR e alta Ki-67 in trattamento attivo può essere considerata nel cancro al seno ER-positivo e HER2-negativo. Tuttavia, è necessario un ulteriore lavoro, compresa la validazione indipendente e possibilmente uno studio prospettico, prima che questi risultati possano essere portati verso la traduzione clinica.
Il nostro articolo solleva diverse questioni aggiuntive. Anche se il Ki-67 è stato studiato come marcatore prognostico nel cancro al seno per più di due decenni, ci sono controversie che circondano i metodi utilizzati per determinare la sua espressione e la validità analitica complessiva dei risultati pubblicati. La validità analitica si riferisce alla capacità di un test di produrre risultati riproducibili e accurati. Affinché un marcatore abbia un valore prognostico e predittivo, è essenziale un punto di cutoff “ottimale” basato sull’evidenza. Così, una ragione di controversia che circonda l’uso del Ki-67 come marcatore è l’assenza di un valore di cutoff standard universalmente accettato, che ha portato all’uso di diversi valori di soglia specifici da parte di diversi laboratori. Il nostro istituto ha precedentemente dimostrato che un valore di cutoff del 10% fornisce i migliori risultati di previsione della prognosi. Questo valore è diverso dal valore di cutoff presentato nel Consenso di San Gallo, che nel 2011 ha definito i tumori a “bassa proliferazione” come quelli con un indice Ki-67 <14%, un cutoff stabilito dal confronto con il test molecolare multigene intrinseco PAM50 per la classificazione del cancro luminoso. Durante la Conferenza di San Gallo del 2013, la maggioranza dei panelisti ha votato per aumentare la soglia indicativa di un alto Ki-67 a ≥20%. Una definizione finale di un unico cutpoint da parte del consenso di San Gallo è rimasta elusiva, a causa della distribuzione continua del Ki-67 e delle barriere analitiche e preanalitiche alla valutazione standardizzata. Il cutoff utilizzato dal nostro istituto è appropriato per la nostra ricerca, ma le discussioni sulla standardizzazione delle valutazioni del Ki-67 per ridurre ulteriormente la variabilità interosservatore continueranno. Bisogna analizzare se i risultati riportati in termini di valore prognostico del Ki-67 sarebbero ricapitolati se si usasse il 14% o il 20% invece del 10%. Quando il valore di cutoff del Ki-67 è stato fissato al 14%, non c’è stata alcuna differenza in base al Ki-67. La RFS in base al Ki-67 non aveva alcuna significatività statistica (; appendice 1) né mostrava la differenza tra il Ki-67 basso e alto in base ai sottoinsiemi di espressione PgR (; appendice 2a, ; appendice 2b). La migliore strategia è quella di utilizzare il Ki-67 come un marcatore continuo, che riflette la biologia della proliferazione tumorale. Inoltre, la decisione di trattamento per i singoli pazienti non dovrebbe dipendere da piccole differenze di Ki-67 intorno a un dato punto di cutoff.
A nostra conoscenza, questo è uno dei più grandi studi retrospettivi per analizzare i dati da un registro di cancro clinico di alta qualità sull’uso di routine e significato prognostico di Ki-67. Anche se retrospettivo, ha il vantaggio di comprendere una popolazione di cancro al seno non selezionato e non metastatico senza bias di selezione. In particolare, le analisi patologiche e dei biomarcatori sono state eseguite prospetticamente in un unico laboratorio accreditato e rappresentano quindi una valutazione “reale” del valore dell’IHC nella pratica clinica.
Nonostante le varie limitazioni del Ki-67 come marcatore, il suo uso clinico nel campo del cancro al seno è stato adottato per diverse ragioni. Viene utilizzato per distinguere i tumori luminali ed è considerato un fattore prognostico. La valutazione di Ki-67 tramite IHC è poco costosa e facile da implementare senza investimenti in attrezzature sofisticate, portando al concetto attraente di Ki-67 come biomarcatore a basso costo. L’importanza della flessibilità clinica è fondamentale, date le incertezze che circondano la personalizzazione delle diverse opzioni di chemioterapia per ogni caso, evidenziando l’importanza di stabilire un ruolo più accurato per Ki-67.
In questo studio, abbiamo trovato che Ki-67 è un marcatore prognostico efficace solo nel contesto del basso stato PgR. Abbiamo inoltre scoperto che i pazienti con bassa PgR e alta espressione di Ki-67 avevano la peggiore prognosi in termini di RFS. Da una prospettiva globale, le firme genomiche rimarranno di difficile accesso nel prossimo futuro per la maggior parte dei pazienti. Il trattamento attivo può essere considerato come il default nei casi di carcinoma mammario precoce ER-positivo e HER2-negativo che soddisfano le condizioni di bassa PgR e alta Ki-67.
5. Conclusioni
I nostri risultati mostrano che Ki-67 ha un valore prognostico per la recidiva e la sopravvivenza in pazienti con cancro al seno precoce ER-positivo e HER2-negativo solo nel contesto di un basso livello di espressione PgR. Quindi, anche l’espressione di PgR dovrebbe essere considerata nella valutazione della prognosi delle pazienti con cancro al seno usando Ki-67.
Data Availability
I dati demografici e clinici raccolti allo scopo dell’analisi statistica per sostenere i risultati di questo studio sono disponibili dall’autore corrispondente su richiesta.
Conflitti di interesse
Gli autori dichiarano che non ci sono conflitti di interesse relativi alla pubblicazione di questo articolo.
Materiale supplementare
Appendice 1: sopravvivenza senza recidiva (RFS) secondo l’indice Ki-67 con un valore di cutoff del 14%. Appendice 2a: sopravvivenza libera da recidiva (RFS) in base al Ki-67 (valore di cutoff 14%) nel sottogruppo a basso recettore del progesterone. Appendice 2b: RFS secondo Ki-67 (valore di cutoff del 14%) nel sottogruppo ad alto recettore del progesterone. (Materiali supplementari)
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