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Introduzione

Per fornire cibo e nutrimento adeguati alla popolazione mondiale che dovrebbe raggiungere i 9 miliardi entro il 2050 (http://www.unpopulation.org), le rese del riso devono aumentare almeno del 60% (FAO 2009). Il riso è l’alimento base di oltre la metà della popolazione mondiale e questa popolazione che consuma riso sta aumentando al ritmo dell’1,098% all’anno (http://esa.un.org/wpp/Excel-Data/population.htm). L’aumento della popolazione significa una maggiore domanda di cibo, acqua e terra in un momento in cui la base di risorse naturali per l’agricoltura si sta degradando perché grandi aree di terreno agricolo vengono deviate dalla produzione di cibo all’industrializzazione e alla produzione di biocarburanti. Un cambiamento climatico imprevedibile sta minacciando di ridurre ulteriormente le terre coltivabili a causa di più casi di siccità e inondazioni (http://www.fao.org/docrep/017/aq191e/aq191e.pdf). Poiché la popolazione in crescita e il cambiamento climatico globale esercitano una pressione crescente sull’approvvigionamento alimentare mondiale, è essenziale continuare a migliorare le prestazioni delle colture in termini di produttività dei cereali per tenere il passo con la crescita della popolazione. L’aumento della produttività delle colture conferito dai tipi di piante create durante il periodo della rivoluzione verde ha sostenuto il boom della popolazione dopo le due guerre mondiali. Da allora, nonostante l’uso di varietà migliorate e di tecnologie avanzate, il potenziale di rendimento delle attuali cultivar di riso è migliorato di poco, il che indica che queste varietà hanno raggiunto un tetto di rendimento (Akita 1994). Recentemente è in corso un tentativo di aumentare il potenziale di rendimento del riso ingegnerizzando un’efficiente fotosintesi di tipo C4 nel riso (Kajala et al. 2011). Per questo, una serie di geni che regolano l’anatomia della foglia e i processi biochimici devono essere inseriti nel riso ed espressi in modo appropriato, cosa che attualmente non è possibile solo con le tecniche convenzionali di miglioramento delle piante. Pertanto, l’ingegneria genetica per migliorare il percorso fotosintetico del riso fornirebbe un’opportunità sufficiente per migliorare l’attuale produttività dei chicchi e il potenziale di rendimento. L’ingegneria genetica fornisce uno strumento di selezione efficiente e preciso in cui solo i geni di interesse possono essere introdotti anche da specie lontanamente imparentate.

Nelle piante C3 come il riso, la CO2 viene assimilata in un composto a 3 carboni dall’enzima fotosintetico ribulosio-1, 5-bisfosfato carbossilasi ossigenasi (Rubisco). Come indica il nome, Rubisco catalizza anche l’ossidazione del ribulosio-1, 5-bisfosfato (RuBP) in un processo dispendioso noto come fotorespirazione che può comportare una perdita fino al 25% del carbonio precedentemente fissato (Sage 2004). A temperature superiori ai 30°C, tipiche delle aree tropicali del mondo in cui si coltiva il riso, il tasso di ossigenazione aumenta sostanzialmente e questo riduce notevolmente l’efficienza fotosintetica delle piante C3 fino al 40% (Ehleringer e Monson 1993). Così, la fotosintesi del riso nei tropici e nelle regioni temperate calde diventa inefficiente. Le piante C4 che hanno un meccanismo di concentrazione di CO2 all’interno delle loro foglie hanno livelli molto ridotti di fotorespirazione e quindi si sono evolute per prosperare in ambienti caldi e aridi e offrono spunti preziosi per le strategie di miglioramento delle colture. Il riso con un meccanismo di fotosintesi C4 avrebbe una maggiore efficienza fotosintetica e utilizzerebbe più efficacemente risorse scarse come terra, acqua e fertilizzanti, in particolare l’azoto (Hibberd et al. 2008). Poiché si comporterà bene in condizioni di alta temperatura e richiederà meno acqua e azoto, il riso C4 conferirebbe benefici a diversi tipi di ecosistemi di riso, comprese le terre marginali.

La fotosintesi di tipo C4 è uno dei tre tipi di meccanismi biochimici adottati dalle piante per fissare la CO2 atmosferica, gli altri sono i percorsi C3 e il metabolismo degli acidi crassulacei (CAM). La fotosintesi C4 si è evoluta più di 66 volte indipendentemente (Sage et al. 2012) almeno in 19 famiglie durante l’evoluzione delle angiosperme da antenati C3 (Muhaidat et al. 2007) e comporta alterazioni delle strutture cellulari, della biochimica e quindi dello sviluppo delle foglie. Questa forma altamente specializzata di fotosintesi ha essenzialmente sviluppato un meccanismo di concentrazione di CO2 intorno all’enzima Rubisco, eliminando così la funzione di ossigenasi della Rubisco e riducendo così lo spreco di energia dovuto alla fotorespirazione (Douce e Heldt 2000). La Rubisco delle specie C4 è più efficiente di quella delle specie C3 in termini di carbossilazione (Kubien et al. 2008). Gli altri vantaggi associati al sistema C4 includono una maggiore efficienza nell’uso dell’acqua perché il gradiente di concentrazione più ripido per la diffusione di CO2 può essere mantenuto attraverso gli stomi parzialmente chiusi, una maggiore efficienza nell’uso delle radiazioni perché l’efficienza della fotosintesi C4 non si satura ad alta intensità luminosa (Rizal et al. 2012) e una maggiore efficienza nell’uso dell’azoto perché richiederà meno Rubisco e quindi meno azoto.

Le piante C4 sono potenzialmente più produttive a temperature più elevate che il riso sperimenta tipicamente. Per trarre vantaggio da questo sistema fotosintetico più efficiente in un momento in cui la popolazione e i prezzi del cibo sono in aumento, ci sono sforzi per inserire il meccanismo C4 come quello trovato nel mais nel riso (Rizal et al. 2012). Questo nuovo approccio per modificare il sistema di fotosintesi del riso è un impegno impegnativo e a lungo termine perché il percorso C4 è molto complesso e molti fattori che controllano il meccanismo sono ancora sconosciuti. Pertanto, richiede l’ingegno e la competenza di scienziati coinvolti in diverse discipline come l’ingegneria genetica, la biochimica, la bioinformatica, la biologia molecolare, la fotosintesi, la biologia dei sistemi, la fisiologia, l’allevamento delle piante, la metabolomica, ecc. Per lo stesso, il consorzio del riso C4 è stato concettualizzato e istituito che ha iniziato il lavoro pratico di ingegneria del riso C4 dal 2009 (http://photosynthome.irri.org/C4rice/). Questa revisione fornisce un aggiornamento sui requisiti per sviluppare il riso C4 e sui progressi fatti nel campo dell’ingegneria genetica. Sulla base dello studio dell’evoluzione del C4 dalle specie C3 e dei cambiamenti associati, le seguenti modifiche sono essenziali per stabilire una via fotosintetica C4 funzionale nel riso.

Aumentare il numero e le dimensioni dei cloroplasti nelle cellule della guaina del fascio di riso

Nel riso più del 90% dei cloroplasti totali si trovano nelle cellule del mesofillo (MC) all’interno della foglia (Yoshimura et al. 2004); mentre, nelle piante C4 sia le MC che le cellule della guaina del fascio (BSC) possiedono lo stesso numero di cloroplasti (Figura 1A e B). Questo perché nelle piante C3, l’intero processo di fotosintesi avviene nelle MC, ma nelle piante C4 il processo di fotosintesi è compartimentato in MC e BSC. Le MC eseguono la prima fissazione di CO2 in cui si forma un composto a 4 carboni chiamato ossalacetato, che viene convertito in acidi C4 come il malato, che viene trasportato nelle BSC, permettendo così un’efficiente assimilazione di CO2 in carboidrati da parte del ciclo di Calvin nelle BSC. Quindi, a differenza delle piante C3, le BSC delle piante C4 hanno funzioni fotosintetiche come la decarbossilazione del composto C4 e il processo del ciclo di Calvin. Per eseguire questi processi, le BSC delle piante C4 sono ingrandite e hanno più cloroplasti, rendendo così le BSC più pronunciate e fotosinteticamente attive. Le BSC nelle specie C3 funzionano per bilanciare la pressione idraulica, impedire l’ingresso dell’aria dagli spazi intercellulari allo xilema, fornire una riserva d’acqua per tamponare le perdite dovute alla traspirazione, permettere l’ingresso e la dispersione nella foglia della luce di maggiore intensità che colpisce le vene (Nikolopoulos et al. 2002). Ulteriori funzioni delle BSC delle piante C3 includono il trasporto di azoto, zolfo, carboidrati e il ruolo nella via di segnalazione che è stato ampiamente rivisto in (Leegood 2008). Nelle specie C4, le BSC e le MC cooperano in una versione a due fasi della fotosintesi. Di conseguenza, per assicurare un contatto diretto tra le BSC e le MC, le piante C4 possiedono un tipo speciale di anatomia fogliare accompagnata dalla proliferazione dei cloroplasti nelle BSC. Per introdurre il percorso C4 nel riso, sono necessari più cloroplasti fotosintetici nelle BSC di quanti ne abbia ora il riso. Questo potrebbe essere fatto esprimendo gli elementi genetici che sono necessari per lo sviluppo dei cloroplasti come i geni Golden2-like (GLK) in un modo specifico della cellula usando i promotori del gene C4 come la fosfoenolo piruvato carbossilasi (PEPC) di Zea mays per l’espressione specifica MC e il promotore della fosfoenolo piruvato carbossilchinasi (PCK) di Zoysia japonica per l’espressione specifica BSC nelle foglie di riso (Matsuoka et al. 1994; Nomura et al. 2005).

I membri della famiglia del gene Golden2-like (GLK) codificano fattori di trascrizione nucleare che sono stati implicati nella regolazione dello sviluppo dei cloroplasti in Arabidopsis, Zea mays, e il muschio Physcomitrella patens (Rossini et al. 2001). In ciascuna di queste specie, i geni GLK esistono come una coppia omologa chiamata GLK1 e GLK2 (Waters et al. 2009). Nel muschio e nell’Arabidopsis i geni GLK sono ridondanti e funzionalmente equivalenti, mentre nel mais e nel sorgo i geni GLK agiscono in maniera cellula-specifica per dirigere lo sviluppo dei cloroplasti dimorfici (Waters et al. 2008; Wang et al. 2013a). Nel mais, i trascritti di Golden2 (G2) e del suo omologo ZmGLK1 si accumulano principalmente nelle cellule BS e M, rispettivamente, suggerendo un ruolo specifico per ciascun gene che regola la differenziazione dimorfica dei cloroplasti (Wang et al. 2013a).

Ridurre la spaziatura delle vene aumentando così la densità delle vene nella foglia

Nelle specie C3, la fotosintesi avviene nei MC. Un numero elevato di MC tra le vene consecutive (Figura 1A) spinge le vene lontano l’una dall’altra aumentando così la spaziatura delle vene o riducendo la densità delle vene. Nelle foglie di riso ci sono meno di 6 vene per mm (Figura 2A), Setaria viridis e sorgo (entrambe sono tipiche specie C4) hanno più di 7 vene per mm (Figura 2B e C). Le foglie C4 hanno in media 2 MC tra le vene (Figura 1B). La maggiore densità di vene nelle foglie delle piante C4 porta a un rapporto quasi uno a uno dei volumi dei tessuti M e BS. L’anatomia interna di una foglia C4 è spesso composta da un modello ripetuto di vena-BS-M-M-BS-vena. Le BSC circondate dalle MC formano una struttura a corona; questo tipo di anatomia fogliare è stato definito “anatomia di Kranz” dal botanico tedesco G. Haberlandt. Le BSC C4 hanno un citoplasma denso e sono piene di un gran numero di cloroplasti (Figura 1B). Per il funzionamento efficiente del percorso C4, è indispensabile uno stretto contatto tra le cellule M e BS e queste sono strettamente interconnesse tra loro con un gran numero di plasmodesmata Dengler e (Nelson 1999). L’anatomia di Kranz si trova con poche variazioni in quasi tutte le stirpi monocotiledoni e dicotiledoni che utilizzano la modalità a due cellule della via fotosintetica C4. Gli studi sull’anatomia e la morfologia delle foglie hanno rivelato diversi geni responsabili della crescita, dello sviluppo o delle deformazioni delle cellule nelle foglie. Un gene ACAULIS1 era responsabile dell’allungamento delle cellule delle foglie (Tsukaya et al. 1993). La mutazione nel gene CURLEY LEAF (CLF) ha prodotto foglie arricciate in Arabidopsis (Kim et al. 1998). L’aumento della terminazione della vena libera, il modello di venatura aperta e la struttura arrotondata della foglia sono stati causati da rotunda 1 (RON1) (Robles et al. 2010). La mutazione nel gene Scarecrow nel mais ha mostrato un aumento del numero di BSC, una differenziazione insolita del cloroplasto BS, una diminuzione delle vene minori e un’alterazione della densità delle vene (Slewinski et al. 2012). Questi studi relativi al pattern anormale della vena causato dalla mutazione di particolari geni forniscono qualche indizio su come l’anatomia di Kranz è regolata e suggeriscono il coinvolgimento di più vie nello sviluppo del pattern di Kranz. La rete di regolazione SCARECROW/SHORTROOT è stata determinata come uno dei componenti importanti richiesti per il patterning dell’anatomia di Kranz perché le foglie delle piante C3 con il gene Scarecrow mutato erano normali, mentre nelle piante C4 la mutazione dello stesso gene danneggiava l’anatomia di Kranz (Slewinski et al. 2012; Wang et al. 2013b). Recentemente, è stato dimostrato che l’introduzione di cromosomi di mais nell’avena potrebbe aumentare la dimensione del BSC e ridurre la spaziatura delle vene nelle foglie di avena C3 dimostrando che l’anatomia della foglia C3 può essere modificata (Tolley et al. 2012). Inoltre, un grande sforzo è stato fatto per lo screening di mutanti di sorgo (C4) con spaziatura delle vene aumentata e mutanti di riso (C3) con spaziatura delle vene ridotta in modo da poter identificare i geni che controllano il tratto della spaziatura delle vene (Rizal et al. 2012).

L’attività del ciclo di Calvin dovrebbe essere significativamente ridotta nel MC e notevolmente aumentata nel BSC del riso

La fotosintesi C4 è caratterizzata da un meccanismo biochimico di pompaggio della CO2 che eleva la concentrazione di CO2 nel sito di Rubisco. Un alto livello di CO2 intorno a Rubisco riduce il tasso di fotorespirazione e aumenta l’assimilazione netta di CO2 portando alla fotosintesi altamente efficiente Weber e von (Caemmerer 2010). Per ottenere questo, l’assimilazione di CO2 in C4 è distribuita su due tipi di cellule, le MC e le BSC (Figura 3). Pertanto, la fissazione del carbonio C4 dipende dall’espressione e dalla localizzazione di geni specifici delle cellule. Le cellule BS e M fotosinteticamente attive vicine interagiscono per eliminare la fissazione di O2 catalizzata da Rubisco. Nelle piante a due cellule di tipo C4, la CO2 è inizialmente fissata nell’acido C4 chiamato ossalacetato nelle cellule MC da una carbossilasi insensibile all’O2 chiamata fosfoenolo piruvato carbossilasi (PEPC, EC 4.1.1.31). L’ossalacetato è poi convertito in malato o aspartato ed è trasportato ai BSC dove è decarbossilato e la CO2 è rilasciata. Questa CO2 viene rifissata da Rubisco e tutte le successive attività del ciclo di Calvin hanno luogo nel cloroplasto delle BSC (Nelson e Langdale 1989). Di conseguenza, per rendere il riso C4 funzionante, l’attività di Rubisco deve essere notevolmente ridotta nelle MC e aumentata nelle BSC, il che confina il ciclo di Calvin nelle BSC del riso, come in un sistema C4. D’altra parte, alcuni geni che codificano gli enzimi C4 come la β anidrasi carbonica (CA) e PEPC devono essere sovraespressi nel citosol dei MC del riso per facilitare la fissazione primaria di CO2 in modo che la CO2 possa essere concentrata e fornita a Rubisco nei BSC. Il ciclo C4 comporta anche un ampio trasporto di metaboliti attraverso la membrana dell’involucro del cloroplasto e il plasmalemma di MC e BSC (Figura 3). Come tale, oltre agli enzimi del nucleo C4 e cioè CA, PEPC, piruvato ortofosfato (Pi) dikinase (PPDK, EC 2.7.9.1), NADP-dipendente malato deidrogenasi (NADP-MDH, EC 1.1.1.82) e NADP-dipendente enzima malico (NADP-ME, EC 1.1.1.40), il percorso C4 richiede anche l’inserimento di trasportatori di metaboliti per ossalacetato, malato, triosiofosfato e piruvato nel riso per fornire una maggiore capacità di trasporto degli intermedi del ciclo C4 in modo che il ciclo di Calvin possa funzionare efficacemente nei BSC (Weber e von Caemmerer 2010).

La fotorespirazione nelle cellule del mesofillo deve essere notevolmente ridotta

Nelle piante C3 la fissazione del carbonio e il ciclo di Calvin avvengono nei MC. Durante la fissazione del carbonio, il ribulosio-1,5-bisfosfato (RuBP) – un composto di cinque carbonio, catalizzato da un enzima ribulosio-1,5-bisfosfato carbossilasi ossigenasi (Rubisco, EC.4.1.1.39) reagisce con la CO2 per formare due molecole di composto a tre carbonio chiamato 3-fosfoglicerato (3-PGA). All’interno del ciclo di Calvin, le due molecole di PGA formano una molecola di zucchero ricca di energia (triosio fosfato) e rigenerano RuBP per il ciclo successivo. Alle attuali concentrazioni di CO2 atmosferica (circa 400 ppm) Rubisco catalizza anche una reazione tra RuBP e O2 che produce una molecola di 2-fosfoglicolato e 3-PGA (Peterhansel e Maurino 2011). Il 2-fosfoglicolato deve essere riconvertito in 3-PGA attraverso il processo chiamato fotorespirazione, che comporta una serie di reazioni biochimiche. Durante questo processo si verifica una perdita di carbonio e azoto precedentemente fissati e deve anche essere utilizzata energia extra (Sharpe e Offermann 2013).

C4 Le piante hanno sviluppato meccanismi per limitare la localizzazione e le attività di Rubisco nelle BSC. Gli MC impediscono spazialmente il contatto tra Rubisco nelle BSC e l’O2 negli spazi intercellulari, impedendo così la perdita di energia attraverso la fotorespirazione. L’eliminazione della fotorespirazione da parte delle piante C4 è evidenziata dal loro punto di compensazione di CO2 molto basso che è quasi zero e da un’efficienza di carbossilazione (CE) costantemente elevata senza rispondere ai cambiamenti delle concentrazioni di O2 (Figura 4). Al contrario, nelle piante C3, con il cambiamento della concentrazione di O2 dal 21% al 2%, il punto di compensazione è diminuito significativamente da 55 a 30 ppm (Tabella 1). Nella Figura 4, il CE è stato calcolato secondo (Li et al. 2009) che ha mostrato che il CE del sorgo non è cambiato significativamente con il cambiamento del livello di O2, ma nel riso c’è stato un miglioramento altamente significativo del CE quando il livello di O2 è stato diminuito dal 21 al 2% (Figura 4 e Tabella 1). L’aumento di CE nel sorgo è stato solo del 6,1% mentre quello nel riso è stato del 41,5% con la diminuzione della concentrazione intercellulare di O2 al 2% (Tabella 1). Questi dati mostrano che c’è un grande potenziale per aumentare la capacità fotosintetica del riso diminuendo la fotorespirazione che a sua volta aumenterebbe la resa in modo sostanziale. Un modo per ridurre la fotorespirazione in MC è ridurre la proteina decarbossilasi della glicina (GDC) in MC e limitare il suo accumulo in BSC in modo che la decarbossilazione della glicina avvenga esclusivamente in BSC, generando così una maggiore concentrazione di CO2 in BSC, simile a quella degli intermedi C3-C4 (Monson e Rawsthorne 2000). Il consorzio del riso C4 sta testando questo approccio utilizzando un microRNA artificiale progettato contro la subunità GDC-H del riso che è guidata dal promotore ZmPEPC (Kajala et al. 2011). Tale meccanismo biochimico richiede una specializzazione cellulare delle BSC che include un aumento del numero di cloroplasti e mitocondri che arricchiscono il contenuto dell’organello delle BSC del riso per aiutare nella ricattura della CO2 rilasciata dalla decarbossilazione della glicina da parte del GDC (Ueno 2011). Un altro approccio che ha avuto successo per catturare la CO2 rilasciata dalla fotorespirazione al sito di fotosintesi è il trasferimento della via catabolica del glicolato di Escherichia coli ai cloroplasti di Arabidopsis thaliana in cui il glicolato nel cloroplasto è stato direttamente convertito in glicerato (Kebeish et al. 2007). Questa strategia che ha ridotto la fotorespirazione e migliorato la fotosintesi in Arabidopsis ha coinvolto la trasformazione nucleare graduale con cinque geni batterici mirati al cloroplasto che codificano glicolato deidrogenasi, gliossilato carboligasi e tartronic semialdeide reduttasi potrebbe essere applicata ad altre piante C3 come il riso, tuttavia, l’uso di geni batterici potrebbe non essere preferito nell’ingegneria del riso C4.

Ingegnerizzazione del percorso C4 nel riso

Si è pensato che il sistema C4 a cella singola potrebbe essere più veloce da installare nelle piante C3. Ci sono tentativi di ingegnerizzare il sistema di fotosintesi a cella singola C4 anche nel riso (Miyao et al. 2011). Per introdurre il sistema a cellula singola C4-like in cui MC è fatto per catturare e rilasciare CO2 nel modo in cui avviene in Hydrilla verticillata (L.f) Royle, quattro enzimi (PEPC, PPDK, NADP-MDH, e NADP-ME) coinvolti nel sistema sono stati iperprodotti nelle foglie di riso transgenico (Ku et al. 1999; Fukayama et al. 2001; Tsuchida et al. 2001; Taniguchi et al. 2008). Alcuni dei principali problemi incontrati che devono essere affrontati per realizzare un percorso monocellulare C4-like nel riso sono: il meccanismo per facilitare l’attività di trasporto della PEP attraverso l’involucro del cloroplasto, l’importazione di OAA nei cloroplasti e la direzione della reazione NADP-ME, il coinvolgimento di NADP-MDH, la presenza di PEPC endogena all’interno del cloroplasto MC del riso e un ulteriore aumento dell’attività di NADP-MDH sono stati riportati come necessari (Miyao et al. 2011). Anche le specie C4 terrestri monocellulari come Bienertia cycloptera, B. sinuspersici e Suaeda aralocaspica, appartenenti alla famiglia delle Chenopodiaceae, necessitano di una compartimentazione spaziale dell’assimilazione e decarbossilazione del carbonio (Chuong et al. 2006). Queste specie hanno cloroplasti dimorfici in questi compartimenti. I tentativi precedenti hanno prodotto un ciclo inutile che era dovuto a nessun cambiamento nell’anatomia, mancanza di trasportatori appropriati e i geni del mais trasformati in riso non erano espressi in modo appropriato in modo specifico della cellula e non erano regolati come nel mais ma erano regolati come le isoforme C3 endogene del riso (Miyao et al. 2011).

Per ingegnerizzare la via fotosintetica da C3 a C4 entro due decenni, che ha richiesto milioni di anni in natura, il consorzio del riso C4 ha iniziato la scoperta simultanea di geni e l’ingegneria di geni già noti nel riso con l’obiettivo di formare riso C4 con l’anatomia di tipo Kranz. I geni C4 come CA, PEPC, PPDK, NADP-ME e NADP-MDH sono stati clonati dal mais e trasformati in riso. Anche i trasportatori che erano sovraespressi nelle vie metaboliche C4 come il trasportatore 2-oxoglutarato/malato (OMT1), il trasportatore dicarbossilato1 (DiT1), il trasportatore dicarbossilato2 (DiT2), il trasportatore PEP/fosfato (PPT1), la proteina dell’involucro del mesofillo (MEP) e il traslocatore trioso-fosfato fosfato (TPT) che sono stati recentemente identificati attraverso la proteomica delle cellule BS e MS del mais (Friso et al. 2010) sono state trasformate in riso (Figura 3). I membri del consorzio del riso C4 sono anche coinvolti nella scoperta di nuovi geni legati all’anatomia di Kranz (Wang et al. 2013b). Una volta testati, i promettenti geni candidati che controllano l’anatomia di Kranz saranno introdotti anche nelle piante di riso che sono state ingegnerizzate con i geni della via biochimica C4.