1 INTRODUZIONE
Le membrane bilayer fosfolipidiche (BLM) rappresentano un sistema modello utile per esaminare gli aspetti fondamentali dei componenti del bilayer lipidico delle membrane cellulari biologiche e, in particolare, per studiare le loro proprietà elastiche. Sono strutture auto-assemblate di molecole anfipatiche con caratteristiche fisiche molto simili a quelle dei cristalli liquidi smectici. La matrice del bilayer lipidico è in grado di incorporare sia molecole idrofobiche che anfipatiche come proteine, altri lipidi, peptidi, steroidi e cosurfattanti. Le proprietà elastiche delle membrane lipidiche considerate come mezzi continui sono state utilizzate in una varietà di studi che vanno dai fenomeni locali, come le interazioni lipidi-lipidi, lipidi-proteine e proteine-proteine, alle fluttuazioni di forma delle intere cellule. Inoltre, la natura idrocarburica liquida del bilayer è mantenuta da interazioni inter-molecolari tra i fosfolipidi su scala nanoscopica: interazioni elettrostatiche e dipolo-dipolo tra i gruppi di testa polari, interazioni mediate dalle molecole d’acqua, e interazioni di dispersione di van der Waals tra le catene idrocarburiche .
Le superfici di un BLM non sono perfettamente planari né rigide. Il sistema BLM è una struttura flessibile quasi bidimensionale che subisce continuamente una varietà di transizioni conformazionali e dinamiche. Inoltre, i BLM artificiali e naturali non sono sistemi isolanti, ma permeabili all’acqua e agli elettroliti che si diffondono attraverso una diversità di pori transmembrana.
I pori transmembrana stocastici sono generati da uno dei seguenti meccanismi: fluttuazioni termiche casuali e distorte (termoporazione), e innesco elettrico (elettroporazione). Le molecole lipidiche all’interno del BLM seguono tre categorie distinte di movimenti termici casuali: traslazioni laterali, parallele alla superficie del bilayer, con il coefficiente di diffusione laterale dell’ordine di 10-7 m2s-1 (Dl), oscillazioni e rotazioni intorno agli assi lipidici perpendicolarmente alla superficie del bilayer.
Le traslazioni laterali con direzioni casuali inducono fluttuazioni locali della densità dei gruppi di testa polari dei lipidi sulle superfici del bilayer. Pertanto, un’istantanea della superficie del bilayer rivela domini locali di dimensione nanoscopica con una maggiore densità di gruppi polari (cioè cluster) così come zone con una densità inferiore. Per certe condizioni fisiche del BLM (pH, temperatura, componenti lipidici, potenziale elettrochimico, ecc.), queste ultime zone rappresentano piccoli difetti locali (cioè dei vuoti) della membrana. In questi domini, le molecole d’acqua possono penetrare la matrice idrofoba del bilayer. Consideriamo il caso di due difetti indipendenti da ogni monostrato che sono allineati in una direzione perpendicolare sulla superficie della membrana. Essi possono generare un poro idrofobico cilindrico con la superficie interna fiancheggiata dalle catene idrofobiche dei lipidi. Quindi questi tipi di pori transitori sono di natura idrofoba. È anche possibile che i gruppi di testa polari, situati in prossimità di un poro idrofobico, obbediscano a rotazioni verso il suo interno. In questo caso, la superficie idrofoba interna dei pori si riveste di gruppi dirigenti polari. Così, questi pori hanno una natura idrofila, non hanno più una geometria cilindrica e hanno più stabilità di quelli idrofobici. In altre parole, le fluttuazioni termiche casuali della densità dei gruppi di testa polari nei due monostrati di BLM sono in grado di generare pori transmembrana stocastici.
La presenza di fluttuazioni di spessore idrofobico all’interno di BLM è stata dimostrata sia dalla teoria che dall’esperimento. Questo è stato ottenuto determinando i valori dello spessore del bilayer (h) da tre procedure indipendenti: misure di capacità elettrica (hc), misure di riflettanza ottica (hr), e calcolo diretto (hav). Tanford (1980) ha calcolato lo spessore del bilayer usando la seguente formula hav = Nl M/ρ, dove Nl, M e ρ sono il numero di lipidi per unità di superficie, il peso molecolare delle catene idrofobiche e la densità della zona idrofoba, rispettivamente. A causa delle “fluttuazioni di spessore” delle regioni idrofobiche, hc dovrebbe essere uguale a hav, mentre, in questo caso, entrambi dovrebbero essere più piccoli di hr dello spessore dello strato polare (htp): hc ≅ hav = hr-htp. Se il bilayer lipidico avesse uno spessore uniforme, allora hc dovrebbe essere uguale a hav. Nel caso del BLM composto da una miscela binaria di lipidi, un’associazione selettiva tra i fosfolipidi avviene in seguito alla comparsa di domini fosfolipidici. Il loro spessore dipende dalla lunghezza della catena idrocarburica dei componenti lipidici. Popescu et al. (1991) hanno dimostrato la comparsa di pori stocastici in BLMs a causa di fluttuazioni nello spessore del bilayer. L’altezza della barriera energetica per la perforazione della membrana in seguito a tale meccanismo è però grande (circa 91 kT, dove k e T sono la costante di Boltzmann e la temperatura assoluta, rispettivamente). In questo caso, il profilo geometrico del poro è di forma ellittica toroidale. È stato anche dimostrato che un tale poro transmebrana potrebbe evolvere verso uno stato stabile. I risultati ottenuti da questo modello erano piuttosto sorprendenti, a causa della rapida scala temporale di chiusura dei pori statistici nelle membrane. Due anni dopo, Zhelev e Needham (1993) hanno creato grandi pori quasistabili in vescicole bilayer lipidiche, mantenendo così la previsione del modello precedente. La resistenza della membrana alla rottura in termini di tensione di linea per un grande poro in vescicole bilayer è stata calcolata da Moroz e Nelson (1997) .
Pori transmembrana stocastici possono anche essere formati da un movimento termico distorto dei lipidi . Questo meccanismo è talvolta chiamato termoporazione. I pori appaiono nella membrana attraverso un processo di attivazione indotto termicamente. In alternativa, il processo di attivazione per la formazione dei pori può essere indotto da un campo elettrico esterno (chiamato anche elettroporazione). Il poro generato dall’elettroporazione è più grande e più stabile. Il meccanismo di elettroporazione è stato proposto per la consegna di farmaci e geni a cellule e tessuti.
I pori proteici transmembrana sono formati da sistemi proteici che coprono una vasta gamma da piccoli canali peptidici (ad esempio gramicidina, alameticina, melittina ecc.) a grandi canali proteici multimerici assemblati. Poiché questi pori sono grandi e pieni d’acqua, le sostanze idrofile, compresi gli ioni, possono diffondere attraverso di essi, dissipando così il potenziale elettrico di membrana. I pori proteici transmembrana sono costituiti da proteine integrali di due grandi classi strutturali: (1) canali selettivi formati da strutture a-eliche transmembrana raggruppate, e (2) canali selettivi, pori e porine formati da strutture monomeriche (es. OmpG), dimeriche (es. canali selettivi Cl-), trimeriche (es. OmpF) o multimeriche transmembrana ß-barile (es. α-emolisina, leucocidine, citolisine) . Il bilayer lipidico può essere utilizzato come un sistema in vitro per studiare questi canali proteici quando sono ricostituiti in una membrana funzionale. Inoltre, i BLM possono essere utilizzati come strumento per l’ingegneria delle proteine di membrana e le sue applicazioni sia nella biofisica a singola molecola che nell’area biotecnologica.
In un altro esempio, la colicina Ia, una proteina secreta da Escherichia coli, forma canali ionici voltaggio-gettati sia nella membrana interna dei batteri bersaglio che nei BLM planari. La colicina Ia è un trasportatore di membrana appartenente alla classe delle tossine batteriche che condividono la stessa strategia: si inseriscono nella membrana di altri batteri concorrenti nutrienti, generando così pori di grandi dimensioni. Di conseguenza, questi pori danneggiano il potenziale elettrochimico di membrana e, infine, provocano la morte di questi batteri concorrenti. Rispetto ai pori stocastici di cui sopra, i pori proteici hanno un diverso meccanismo di formazione e anche diverse proprietà. Mentre un poro stocastico “dimentica” il suo meccanismo di generazione, alcuni dei pori proteici transmembrana (ad esempio la colicina Ia) sembrano mostrare effetti di “memoria”, almeno sotto l’influenza di una specifica sequenza di impulsi utilizzati per la stimolazione elettrica BLM.
Pori genetici sono stati incontrati nella parete di vasi sinusoidali del fegato di mammifero. Le cellule endoteliali di questi vasi hanno numerosi pori a setaccio. Questi pori di circa 0,1 μm di diametro permettono a una parte del plasma sanguigno e ai chilomicroni di passare dallo spazio sinusoidale allo spazio di Disse. Pertanto, i pori endoteliali controllano lo scambio di fluidi, soluti e particelle tra il sangue sinusoidale e lo spazio di Disse.
In questo lavoro, abbiamo usato la teoria dell’elasticità dei mezzi continui per descrivere la comparsa di pori stocastici attraverso BLMs planari.