3.1.2 Azydki
Azydek jest uważany za jedną z najbardziej odpowiednich grup dla reakcji bioortogonalnych i chemii kliknięć. W przeciwieństwie do ketonów i aldehydów, azydki prawie nie występują w układach biologicznych. Azydki posiadają wysoką energię wewnętrzną, ale nie mają naturalnego partnera reakcji (King i Wagner, 2014), mają małe rozmiary i neutralny ładunek ogólny, a wreszcie są stabilne kinetycznie w warunkach fizjologicznych.
Ligacja Staudingera (Staudinger i Hauser, 1921) wydaje się być dobrym kandydatem do reakcji biokoniugacji z wykorzystaniem azydków. W reakcji tej azydki reagują z odczynnikami trifenylofosfinowymi zawierającymi pułapkę elektrofilową w celu wytworzenia aza-ylidowego intermediatu, który reaguje z elektrofilową estrową grupą karbonylową tworząc pięcioczłonowy pierścień, który ulega hydrolizie w celu wytworzenia końcowego stabilnego wiązania amidowego (Rys. 5.6A) (Steen Redeker i in., 2013; Staudinger i Hauser, 1921). Wkrótce potem opisano nowy wariant tej reakcji (King i Wagner, 2014; Saxon i Bertozzi, 2000; Saxon i wsp., 2000; Nilsson i wsp., 2000), określany jako „bezśladowe ligowanie Staudingera”, w którym końcowy produkt w postaci wiązania amidowego jest uwalniany od cząsteczki tlenku fosfiny.
Rys. 5.6. Przykłady reakcji biokoniugacji z azydkami. (A) ligacja Staudingera; (B) cykloaddycja azydkowo-alkilowa katalizowana miedzią; (C) cykloaddycja azydkowo-alkilowa promowana szczepem; (D) cykloaddycja z oksanorbornadienami. UAA, nienaturalne aminokwasy.
Ligacja Staudingera została wykorzystana w wielu zastosowaniach. Na przykład, Raines i wsp. zastosowali tę reakcję jako bezcysteinową alternatywę dla NCL do ligacji peptydów (Nilsson i wsp., 2001) oraz w połączeniu z NCL do składania sztucznej RNAazy A (Nilsson i wsp., 2005). Ponadto, był on używany w innych zastosowaniach, takich jak unieruchamianie białek na stałym podłożu do obrazowania in vitro i in vivo (Saxon i Bertozzi, 2000; Prescher i in., 2004), znakowanie biomolekuł in vitro i in vivo (Saxon i Bertozzi, 2000; Prescher i in, 2004; Vocadlo et al., 2003), wzbogacanie białek (Vocadlo et al., 2003) i wykrywanie (Charron et al., 2009), jak również (Lemieux et al., 2003) modyfikacja białek.
Niemniej jednak, ligacja Staudingera ma pewne wady. Mianowicie, jej powolna kinetyka (stała szybkości drugiego rzędu w niskim zakresie 10-3 M-1s-1) (Lin i in., 2005), labilność oksydacyjna związków fosfinowych (konieczność stosowania stosunkowo wysokich stężeń odczynnika fosfinowego) oraz potencjalna reaktywność krzyżowa fosfin z disulfidami (Lang i Chin, 2014; King i Wagner, 2014).
Azydki mogą reagować z alkinami w katalizowanej przez Cu(I)cykloaddycji azydkowo-alkynowej (CuAAC) lub 1,3-dipolarnej cykloaddycji (Rys. 5.6B), jednym z najbardziej standardowych przykładów reakcji chemii kliknięć (Rostovtsev i in., 2002; Tornøe i in., 2002). Reakcja ta cieszy się dużym zainteresowaniem w naukach biologicznych ze względu na dobrą selektywność, wysoką wydajność i łagodne warunki reakcji (temperatura pokojowa w różnych rozpuszczalnikach). Dodatkowo, zarówno azydki jak i alkiny są wprowadzane do białek bez wpływu na ich strukturę i funkcję (Steen Redeker i in., 2013). Azydek i alkin mogą bardzo szybko utworzyć stabilne wiązanie 1,2,3-triazolowe w warunkach fizjologicznych, w obecności Cu(I). Mechanizm zaproponowany przez Sharplessa i wsp. (Rostovtsev i wsp., 2002) opisuje najpierw wprowadzenie terminalnego alkinu do acetylidu miedzi, a następnie atak azydku (King i Wagner, 2014). Ostatnio mechanizm ten został jeszcze bardziej dopracowany i zaproponowano pośrednictwo dikopiranu (Worrell i in., 2013). Głównymi wadami tej reakcji są reakcje uboczne zależne od Cu(I)oraz cytotoksyczność Cu(I) (Baskin i in., 2007; Plass i in., 2011), które ograniczyły jej zastosowanie głównie do znakowania w przestrzeni pozakomórkowej (King i Wagner, 2014). CuAAC znalazł szerokie zastosowanie w wielu różnych badaniach biologicznych, np. do znakowania fosfolipidów w celu ich obrazowania in vivo (Jao i in., 2009) oraz in vitro (Neef i Schultz, 2009), do remodelowania powierzchni wirusów (Steinmetz i in., 2009), do modyfikacji/oznakowania białek in vitro i in vivo (Link i Tirrell, 2003; Ngo i Tirrell, 2011; Liu i Schultz, 2010; Deiters i in., 2003), do znakowania kwasów nukleinowych (Weisbrod i Marx, 2008) oraz profilowania sond opartego na powinowactwie (Speers i in., 2003).
Różne podejścia zostały opracowane w celu przezwyciężenia cytotoksyczności miedzi. Mianowicie, użycie rozpuszczalnych w wodzie ligandów do koordynacji Cu(I), użycie organicznych azydków chelatujących miedź oraz wprowadzenie szczepu pierścieniowego do cząsteczki alkinowej. W pierwszym przypadku, ligandy rozpuszczalne w wodzie koordynują Cu(I) tworząc aktywowany katalizator miedziowy zdolny do promowania CuAAC przy niskich mikromolarnych stężeniach metalu redukując jednocześnie potencjalną toksyczność Cu(I) (Besanceney-Webler et al., 2011; Del Amo i Wang, 2010; Hong et al., 2009; Kennedy et al., 2011). W drugim przypadku, efektywne stężenie Cu(I) jest podnoszone w miejscu reakcji poprzez zastosowanie ligandów azydkowych zawierających wewnętrzną cząsteczkę chelatującą miedź (Brotherton i in., 2009; Kuang i in., 2010; Uttamapinant i in., 2012). Ostatnia strategia polega na wykorzystaniu alkinów, które zostały aktywowane do reakcji z poprawioną kinetyką przy braku katalizatora. W tym względzie, zastosowanie cząsteczek cyklooktynowych zwiększa reaktywność w wyniku uwolnienia pierścienia (Steen Redeker et al., 2013; Baskin et al., 2007; Plass et al., 2011). Promowana przez szczep cykloaddycja azydkowo-alkilowa (SPAAC) (Rys. 5.6C) stała się potężnym narzędziem nie tylko do znakowania białek i przeciwciał, ale także do innych zastosowań, takich jak analiza Western Blot bez przeciwciał (Boutureira i in., 2015), ponieważ nie są wymagane dodatkowe odczynniki lub toksyczne metale, które mogą uszkodzić biomolekuły. Przykładowo, Bertozzi i wsp. udowodnili możliwość jej zastosowania przy modyfikacji oczyszczonych białek (Baskin i wsp., 2007). W dalszych eksperymentach reakcja ta została z powodzeniem zastosowana in vitro do komórek fibroblastów (Baskin i in., 2007). Ponadto, SPAAC wykorzystano do obrazowania guzów u żywych myszy za pomocą nanocząsteczek (Koo i in., 2012) oraz 18F PET, gdzie fluor został przyłączony zarówno do azydku, jak i cykloalkiliny (Jeon i in., 2012). Inne obszary zastosowań znaleziono w modyfikacji wirusów i znakowaniu DNA (Qiu i in., 2013). Jednak złożona synteza cyklooktyn oraz fakty, że ich zwiększona masywność i hydrofobowość może wpływać na strukturę i stabilność białek (Kim i in., 2013), a ich zwiększona aktywacja może sprzyjać reakcjom ubocznym z naturalnie występującymi tiolami, można uznać za niekorzystne.
Bezelektronowe azydki sulfonylowe mogą również reagować z aktywowanymi alkenami (oksanorbornadienami lub norbornenami) w bezmetalowej cykloaddycji (Rys. 5.6D), podobnej do SPAAC (Alder, 1930; Huisgen i in., 1980). Produktem cykloaddycji azydkowo-alkenowej jest jednak stosunkowo niestabilna triazolina, w przeciwieństwie do triazoli aromatycznych powstających w klasycznej cykloaddycji typu „click”. Oksanorbornadien, który jest zarówno naprężony jak i pozbawiony elektronów został użyty jako dipolarofil w reakcji z azydkami (van Berkel et al., 2008). W tym przypadku, napięte wiązanie podwójne w oksanorbornadienie reaguje z azydkami tworząc pośrednie triazoliny, które spontanicznie przechodzą retro reakcję Dielsa-Aldera, z uwolnieniem furanu, prowadząc do stabilnych 1,2,3- lub 1,4,5-triazoli. Reakcja ta została wykorzystana do selektywnej biokoniugacji oksanorbornadienu z białkiem i cyklicznym peptydem modyfikowanym azydkiem w wodnych buforach. Chociaż oksanorbornadieny są łatwiejsze w syntezie niż ich odpowiedniki cyklooktynowe, ta reakcja cykloaddycji jest dość powolna i nie do końca chemoselektywna w odniesieniu do innych grup funkcyjnych występujących w białkach, co mogło ograniczyć jej szerokie zastosowanie (Lang i Chin, 2014; van Berkel et al., 2008).
.