Free Press

Introduction

Aby zapewnić odpowiednią żywność i odżywianie światowej populacji, która ma osiągnąć 9 miliardów do 2050 roku (http://www.unpopulation.org), wydajność ryżu musi wzrosnąć o co najmniej 60% (FAO 2009). Ryż jest podstawowym pożywieniem dla ponad połowy ludności świata, a liczba ludności spożywającej ryż rośnie w tempie 1,098% rocznie (http://esa.un.org/wpp/Excel-Data/population.htm). Rosnąca liczba ludności oznacza większe zapotrzebowanie na żywność, wodę i ziemię w czasie, gdy baza zasobów naturalnych dla rolnictwa ulega degradacji, ponieważ duże obszary gruntów rolnych są przenoszone z produkcji żywności do uprzemysłowienia i produkcji biopaliw. Nieprzewidywalna zmiana klimatu zagraża dalszemu ograniczeniu gruntów nadających się do produkcji rolnej ze względu na częstsze przypadki suszy i powodzi (http://www.fao.org/docrep/017/aq191e/aq191e.pdf). Ponieważ rosnąca liczba ludności i globalna zmiana klimatu wywierają coraz większą presję na światowe zaopatrzenie w żywność, istotne jest, abyśmy nadal poprawiali wydajność upraw pod względem produktywności ziarna, aby dotrzymać kroku wzrostowi liczby ludności. Wzrost wydajności upraw dzięki rodzajom roślin stworzonym w okresie zielonej rewolucji przyczynił się do wzrostu liczby ludności po dwóch wojnach światowych. Od tego czasu, pomimo stosowania ulepszonych odmian i zaawansowanych technologii, potencjał plonowania współczesnych odmian ryżu uległ jedynie niewielkiej poprawie, co wskazuje, że odmiany te osiągnęły pułap plonowania (Akita 1994). Ostatnio podejmowane są próby zwiększenia potencjału plonowania ryżu poprzez inżynierię wydajnej fotosyntezy typu C4 (Kajala i in. 2011). W tym celu zestaw genów regulujących anatomię liści i procesy biochemiczne musi być wprowadzony do ryżu i wyrażony w odpowiedni sposób, co obecnie nie jest możliwe wyłącznie za pomocą konwencjonalnych technik hodowli roślin. Dlatego inżynieria genetyczna w celu poprawy szlaku fotosyntezy ryżu zapewniłaby wystarczającą możliwość zwiększenia rzeczywistej produktywności ziarna, jak również potencjału plonowania. Inżynieria genetyczna stanowi skuteczne i precyzyjne narzędzie hodowlane, w którym tylko interesujące nas geny mogą być wprowadzone nawet z odległych gatunków.

W roślinach C3, takich jak ryż, CO2 jest asymilowany do związku 3-węglowego przez enzym fotosyntetyczny oksygenazę karboksylazy rybulozo-1, 5-bisfosforanowej (Rubisco). Jak sama nazwa wskazuje, Rubisco katalizuje również utlenianie rybulozy-1, 5-bisfosforanu (RuBP) w nieekonomicznym procesie zwanym fotorespiracją, który może powodować utratę do 25% wcześniej związanego węgla (Sage 2004). W temperaturze powyżej 30°C, która jest typowa dla tropikalnych obszarów uprawy ryżu na świecie, tempo natleniania znacznie wzrasta, a to znacznie zmniejsza wydajność fotosyntezy roślin C3 do 40% (Ehleringer i Monson 1993). W ten sposób fotosynteza ryżu w tropikach i ciepłych regionach umiarkowanych staje się nieefektywna. Rośliny C4, które posiadają mechanizm koncentracji CO2 w liściach, mają bardzo zredukowany poziom fotorespiracji i dlatego ewoluowały, aby rozwijać się w gorących, suchych środowiskach i oferują cenne spostrzeżenia dla strategii ulepszania upraw. Ryż z mechanizmem fotosyntezy C4 miałby zwiększoną wydajność fotosyntezy przy jednoczesnym wykorzystaniu ograniczonych zasobów, takich jak ziemia, woda i nawozy, zwłaszcza azot, bardziej efektywnie (Hibberd et al. 2008). Ponieważ dobrze radzi sobie w wysokiej temperaturze, jak również wymaga mniej wody i azotu, ryż C4 przyniósłby korzyści różnym typom ekosystemów ryżowych, w tym na terenach marginalnych.

Fotosynteza typu C4 jest jednym z trzech typów mechanizmów biochemicznych przyjętych przez rośliny do wiązania atmosferycznego CO2, pozostałe to ścieżki C3 i metabolizmu kwasów fulerenowych (CAM). Fotosynteza C4 ewoluowała ponad 66 razy niezależnie (Sage et al. 2012) co najmniej w 19 rodzinach podczas ewolucji okrytozalążkowych od przodków C3 (Muhaidat et al. 2007) i pociąga za sobą zmiany w strukturach komórkowych, biochemii, a tym samym w rozwoju liści. Ta wysoce wyspecjalizowana forma fotosyntezy zasadniczo rozwinęła mechanizm koncentracji CO2 wokół enzymu Rubisco, eliminując w ten sposób funkcję oksygenazy Rubisco i redukując straty energii w wyniku fotorespiracji (Douce i Heldt 2000). Rubisco z gatunków C4 jest bardziej wydajna niż z gatunków C3 pod względem karboksylacji (Kubien et al. 2008). Inne powiązane korzyści systemu C4 obejmują wyższą wydajność wykorzystania wody, ponieważ bardziej stromy gradient stężenia dla dyfuzji CO2 może być utrzymywany przez częściowo zamknięte aparaty szparkowe, wyższą wydajność wykorzystania promieniowania, ponieważ wydajność fotosyntezy C4 nie nasyca się przy wysokim natężeniu światła (Rizal et al. 2012) i wyższą wydajność wykorzystania azotu, ponieważ będzie wymagać mniej Rubisco, a tym samym mniej azotu.

Rośliny C4 są potencjalnie bardziej produktywne w wyższych temperaturach, których zazwyczaj doświadcza ryż. Aby wykorzystać ten bardziej wydajny system fotosyntezy w czasie, gdy populacja i ceny żywności gwałtownie rosną, podejmowane są wysiłki w kierunku wprowadzenia do ryżu mechanizmu C4, takiego jak ten występujący w kukurydzy (Rizal et al. 2012). To nowatorskie podejście do modyfikacji systemu fotosyntezy ryżu jest wyzwaniem i długotrwałym przedsięwzięciem, ponieważ szlak C4 jest bardzo złożony, a wiele czynników kontrolujących ten mechanizm jest wciąż nieznanych. Dlatego wymaga to pomysłowości i wiedzy naukowców zajmujących się różnymi dziedzinami, takimi jak inżynieria genetyczna, biochemia, bioinformatyka, biologia molekularna, fotosynteza, biologia systemów, fizjologia, hodowla roślin, metabolomika, itp. Dla tego samego, konsorcjum ryżowe C4 zostało stworzone i ustanowione, które rozpoczęło praktyczną pracę nad inżynierią ryżu C4 od 2009 roku (http://photosynthome.irri.org/C4rice/). W niniejszym przeglądzie przedstawiono aktualne wymagania dotyczące rozwoju ryżu C4 oraz postępy poczynione w dziedzinie inżynierii genetycznej. Na podstawie badań nad ewolucją C4 z gatunków C3 i związanych z tym zmian, następujące modyfikacje są niezbędne do ustanowienia funkcjonalnej ścieżki fotosyntezy C4 w ryżu.

Zwiększenie liczby i rozmiaru chloroplastów w komórkach osłonki wiązki ryżu

W ryżu ponad 90% wszystkich chloroplastów znajduje się w komórkach mezofilu (MCs) w liściu (Yoshimura et al. 2004); podczas gdy w roślinach C4 zarówno MCs jak i komórki osłonki wiązki (BSCs) posiadają równą liczbę chloroplastów (Rysunek 1A i B). Wynika to z faktu, że u roślin C3 cały proces fotosyntezy zachodzi w MC, natomiast u roślin C4 proces fotosyntezy jest rozdzielony na MC i BSC. W MC zachodzi pierwsza fiksacja CO2, podczas której powstaje 4-węglowy związek zwany oksalooctanem, który jest przekształcany w kwasy C4, takie jak jabłczan, które są transportowane do BSC, co umożliwia wydajną asymilację CO2 do węglowodanów w cyklu Calvina w BSC. Dlatego też, w przeciwieństwie do roślin C3, BSCs roślin C4 pełnią funkcje fotosyntetyczne, takie jak dekarboksylacja związków C4 i proces cyklu Calvina. Aby realizować te procesy, BSCs u roślin C4 są powiększone i posiadają więcej chloroplastów, dzięki czemu BSCs są bardziej wyraziste i aktywne fotosyntetycznie. BSCs u gatunków C3 pełnią funkcję równoważenia ciśnienia hydraulicznego, zapobiegają przedostawaniu się powietrza z przestrzeni międzykomórkowych do ksylemu, stanowią rezerwuar wody buforujący straty spowodowane transpiracją, umożliwiają wnikanie i rozpraszanie do wnętrza liścia światła o większej intensywności, które dociera do żyłek (Nikolopoulos et al. 2002). Dodatkowe funkcje BSCs roślin C3 obejmują transport azotu, siarki, węglowodanów oraz rolę w szlaku sygnalizacyjnym, co zostało obszernie omówione w (Leegood 2008). U gatunków C4, BSCs i MCs współpracują w dwuetapowej wersji fotosyntezy. W rezultacie, aby zapewnić bezpośredni kontakt pomiędzy BSCs i MCs, rośliny C4 posiadają specjalny rodzaj anatomii liścia, któremu towarzyszy proliferacja chloroplastów w BSCs. Aby wprowadzić ścieżkę C4 do ryżu, potrzeba więcej fotosyntetyzujących chloroplastów w BSCs niż ryż posiada obecnie. Można tego dokonać poprzez nadmierną ekspresję elementów genetycznych niezbędnych do rozwoju chloroplastów, takich jak geny Golden2-like (GLK) w sposób specyficzny dla danej komórki, stosując promotory genów C4, takie jak promotor karboksylazy fosfoenolopirogronianowej (PEPC) Zea mays dla ekspresji specyficznej dla MC i promotor karboksykinazy fosfoenolopirogronianowej (PCK) Zoysia japonica dla ekspresji specyficznej dla BSC w liściach ryżu (Matsuoka i in. 1994; Nomura i wsp. 2005).

Członkowie rodziny genów GLK (Golden2-like) kodują jądrowe czynniki transkrypcyjne, które zostały przypisane do regulacji rozwoju chloroplastów w Arabidopsis, Zea mays i mchu Physcomitrella patens (Rossini et al. 2001). U każdego z tych gatunków geny GLK występują jako homologiczne pary o nazwach GLK1 i GLK2 (Waters i in. 2009). U mchu i Arabidopsis geny GLK są redundantne i funkcjonalnie równoważne, natomiast u kukurydzy i sorgo geny GLK działają w sposób specyficzny dla typu komórki, kierując rozwojem dimorficznych chloroplastów (Waters i wsp. 2008; Wang i wsp. 2013a). U kukurydzy transkrypty Golden2 (G2) i jego homologu ZmGLK1 gromadzą się przede wszystkim odpowiednio w komórkach BS i M, co sugeruje specyficzną rolę każdego z genów regulujących różnicowanie chloroplastów dimorficznych (Wang et al. 2013a).

Zmniejszenie odstępów między żyłami, a tym samym zwiększenie gęstości żył w liściu

W gatunkach C3 fotosynteza zachodzi w MCs. Duża liczba MC pomiędzy kolejnymi żyłkami (rysunek 1A) odsuwa żyłki daleko od siebie zwiększając w ten sposób odstępy między żyłkami lub zmniejszając ich gęstość. W liściach ryżu jest mniej niż 6 żył na mm (Rysunek 2A), Setaria viridis i sorgo (oba są typowymi gatunkami C4) mają więcej niż 7 żył na mm (Rysunek 2B i C). Liście C4 mają średnio 2 MC pomiędzy żyłkami (Rysunek 1B). Większa gęstość żył w liściach roślin C4 prowadzi do niemal identycznego stosunku objętości tkanek M i BS. Wewnętrzna anatomia liścia C4 często składa się z powtarzającego się wzoru żyła-BS-M-M-BS-żyła. BSC otoczone przez MC tworzą strukturę przypominającą wieniec; ten typ anatomii liścia został określony przez niemieckiego botanika G. Haberlandta mianem „anatomii Kranza”. C4 BSCs mają gęstą cytoplazmę i są wypełnione dużą liczbą chloroplastów (Rysunek 1B). Dla sprawnego funkcjonowania szlaku C4 niezbędny jest ścisły kontakt między komórkami M i BS, które są ze sobą ściśle połączone dużą liczbą plazmodesm Dengler i (Nelson 1999). Anatomia Kranza występuje z niewielkim zróżnicowaniem u prawie wszystkich jednoliściennych i dwuliściennych linii, które wykorzystują dwukomórkowy tryb szlaku fotosyntezy C4. Badania nad anatomią i morfologią liści ujawniły kilka genów odpowiedzialnych za wzrost, rozwój lub deformacje komórek w liściach. Gen ACAULIS1 był odpowiedzialny za wydłużanie się komórek liścia (Tsukaya i in. 1993). Mutacja w genie CURLEY LEAF (CLF) powodowała powstawanie liści kędzierzawych u Arabidopsis (Kim i in. 1998). Zwiększenie liczby wolnych zakończeń żył, otwarty wzór żyłkowania i zaokrąglona struktura liści były spowodowane przez rotundę 1 (RON1) (Robles i wsp. 2010). Mutacja w genie Scarecrow u kukurydzy wykazała wzrost liczby BSC, nietypowe zróżnicowanie chloroplastu BS, zmniejszenie liczby drobnych żyłek i zmianę gęstości żył (Ślewiński i wsp. 2012). Powyższe badania dotyczące nieprawidłowego wzoru żył spowodowanego mutacją poszczególnych genów dostarczają pewnych wskazówek na temat regulacji anatomii wzoru Kranza i sugerują zaangażowanie wielu ścieżek w rozwój wzoru Kranza. Sieć regulacyjna SCARECROW/SHORTROOT została uznana za jeden z ważnych komponentów wymaganych do kształtowania anatomii Kranza, ponieważ liście roślin C3 ze zmutowanym genem Scarecrow były normalne, podczas gdy u roślin C4 mutacja w tym samym genie uszkadzała anatomię Kranza (Slewinski i wsp. 2012; Wang i wsp. 2013b). Ostatnio wykazano, że wprowadzenie chromosomów kukurydzy do owsa może zwiększyć rozmiar BSC i zmniejszyć odstępy między żyłkami w liściach owsa C3 wykazując, że anatomia liścia C3 może być modyfikowana (Tolley i wsp. 2012). Ponadto, duży wysiłek został włożony w badania mutantów sorgo (C4) o zwiększonym rozstawie żył i mutantów ryżu (C3) o zmniejszonym rozstawie żył, tak aby można było zidentyfikować geny kontrolujące cechę rozstawu żył (Rizal et al. 2012).

Aktywność cyklu Calvina powinna być znacznie zmniejszona w MC i znacznie zwiększona w BSC ryżu

Fotosynteza C4 charakteryzuje się biochemicznym mechanizmem pompowania CO2, który podnosi stężenie CO2 w miejscu Rubisco. Wysoki poziom CO2 wokół Rubisco zmniejsza tempo fotorespiracji i zwiększa asymilację CO2 netto prowadząc do wysoko wydajnej fotosyntezy Webera i von (Caemmerer 2010). Aby to osiągnąć, asymilacja CO2 w C4 jest rozłożona na dwa typy komórek, MCs i BSCs (Rysunek 3). Dlatego wiązanie węgla w C4 zależy od specyficznej dla komórek ekspresji i lokalizacji genów. Sąsiadujące ze sobą fotosyntetycznie aktywne komórki BS i M współdziałają w celu wyeliminowania wiązania O2 katalizowanego przez Rubisco. W roślinach dwukomórkowych typu C4 CO2 jest najpierw wiązany do kwasu C4 zwanego oksalooctanem w MC przez niewrażliwą na O2 karboksylazę zwaną karboksylazą pirogronianu fosfoenolu (PEPC, EC 4.1.1.31). Oksalooctan jest następnie przekształcany w jabłczan lub asparaginian i transportowany do BSC, gdzie jest dekarboksylowany i uwalniany jest CO2. CO2 jest ponownie wiązany przez Rubisco, a wszystkie kolejne aktywności cyklu Calvina zachodzą w chloroplastach BSCs (Nelson i Langdale 1989). W konsekwencji, aby ryż C4 mógł funkcjonować, aktywność Rubisco musi być znacznie zredukowana w MCs i zwiększona w BSCs, co spowoduje, że cykl Calvina będzie ograniczony do BSCs ryżu, tak jak w systemie C4. Z drugiej strony, niektóre geny kodujące enzymy C4, takie jak β anhydraza węglowa (CA) i PEPC, muszą ulegać nadmiernej ekspresji w cytozolu MC ryżu, aby ułatwić pierwotne wiązanie CO2, dzięki czemu CO2 może być skoncentrowany i dostarczony do Rubisco w BSC. Cykl C4 obejmuje również intensywny transport metabolitów przez błonę otoczki chloroplastu oraz plazmalemmę MC i BSC (Rysunek 3). W związku z tym, oprócz podstawowych enzymów C4, czyli CA, PEPC, dikinazy ortofosforanu pirogronianu (Pi) (PPDK, EC 2.7.9.1), dehydrogenazy jabłczanowej zależnej od NADP (NADP-MDH, EC 1.1.1.82) i enzymu jabłkowego zależnego od NADP (NADP-ME, EC 1.1.1.40), szlak C4 wymaga również wprowadzenia do ryżu transporterów metabolitów dla oksalooctanu, jabłczanu, triozo-fosforanu i pirogronianu w celu zapewnienia zwiększonej zdolności transportowej dla intermediatów cyklu C4, tak aby cykl Calvina mógł efektywnie funkcjonować w BSCs (Weber i von Caemmerer 2010).

Fotorespiracja w komórkach mezofilu musi być znacznie ograniczona

W roślinach C3 wiązanie węgla i cykl Calvina zachodzą w MC. Podczas wiązania węgla, rybulozo-1,5-bisfosforan (RuBP) – związek pięciowęglowy, katalizowany przez enzym oksygenazę karboksylazy rybulozo-1,5-bisfosforanu (Rubisco, EC.4.1.1.39) reaguje z CO2 tworząc dwie cząsteczki związku 3-węglowego zwanego 3-fosfoglicerynianem (3-PGA). W cyklu Calvina, dwie cząsteczki PGA tworzą bogatą w energię cząsteczkę cukru (fosforan triozy) i regenerują RuBP dla następnego cyklu. Przy obecnych stężeniach atmosferycznego CO2 (ok. 400 ppm) Rubisco katalizuje również reakcję pomiędzy RuBP i O2, w wyniku której powstaje po jednej cząsteczce 2-fosfoglikolanu i 3-PGA (Peterhansel i Maurino 2011). 2-fosfoglikolan musi zostać przekształcony z powrotem do 3-PGA w procesie zwanym fotorespiracją, w którym zachodzi szereg reakcji biochemicznych. Podczas tego procesu następuje utrata wcześniej utrwalonego węgla i azotu, a także musi zostać zużyta dodatkowa energia (Sharpe i Offermann 2013).

C4 Rośliny wykształciły mechanizmy ograniczające lokalizację i aktywność Rubisco w BSCs. MCs przestrzennie zapobiegają kontaktowi Rubisco w BSCs z O2 w przestrzeniach międzykomórkowych, zapobiegając w ten sposób utracie energii poprzez fotorespirację. O eliminacji fotorespiracji przez rośliny C4 świadczy ich bardzo niski punkt kompensacji CO2, który jest bliski zeru oraz stale wysoka wydajność karboksylacji (CE) bez reakcji na zmiany stężenia O2 (rys. 4). Z kolei u roślin C3, przy zmianie stężenia O2 z 21% do 2%, punkt kompensacji znacznie się obniżył z 55 do 30 ppm (tab. 1). Na rysunku 4 obliczono CE wg (Li i wsp. 2009), z którego wynika, że CE sorgo nie zmieniało się istotnie wraz ze zmianą poziomu O2, natomiast u ryżu nastąpiła wysoce istotna poprawa CE przy obniżeniu poziomu O2 z 21 do 2% (rys. 4 i tab. 1). Wzrost CE w sorgo wynosił tylko 6,1%, podczas gdy w ryżu 41,5% przy obniżeniu międzykomórkowego stężenia O2 do 2% (Tabela 1). Dane te pokazują, że istnieje duży potencjał do zwiększenia zdolności fotosyntetycznej ryżu poprzez zmniejszenie fotorespiracji, co z kolei znacznie zwiększyłoby plon. Jednym ze sposobów zmniejszenia fotorespiracji w MC jest redukcja białka dekarboksylazy glicyny (GDC) w MC i ograniczenie jego akumulacji w BSC, tak aby dekarboksylacja glicyny zachodziła wyłącznie w BSC, generując tym samym wyższe stężenie CO2 w BSC, podobnie jak to ma miejsce w intermediatach C3-C4 (Monson i Rawsthorne 2000). Konsorcjum ryżowe C4 testuje to podejście wykorzystując sztuczne mikroRNA zaprojektowane przeciwko podjednostce GDC-H ryżu, które jest napędzane przez promotor ZmPEPC (Kajala et al. 2011). Taki biochemiczny mechanizm wymaga komórkowej specjalizacji BSCs, która obejmuje wzrost liczby chloroplastów i mitochondriów wzbogacających zawartość organelli ryżowych BSCs, aby pomóc w wychwytywaniu CO2 uwalnianego w procesie dekarboksylacji glicyny przez GDC (Ueno 2011). Innym podejściem, które odniosło sukces w przechwytywaniu CO2 uwolnionego przez fotorespirację do miejsca fotosyntezy jest przeniesienie szlaku katabolicznego glikolanu Escherichia coli do chloroplastów Arabidopsis thaliana, w którym glikolan w chloroplaście został bezpośrednio przekształcony w glicerynian (Kebeish et al. 2007). Ta strategia, która zmniejszyła fotorespirację i zwiększyła fotosyntezę u Arabidopsis, obejmowała stopniową transformację jądrową z pięcioma bakteryjnymi genami ukierunkowanymi na chloroplasty, kodującymi dehydrogenazę glikolanową, karboligazę glioksylanową i reduktazę semialdehydu tartronowego, może być zastosowana do innych roślin C3, takich jak ryż, jednak użycie genów bakteryjnych może nie być preferowane w inżynierii ryżu C4.

Engineering of C4 pathway into rice

Pomyślano, że jednokomórkowy system C4 może być szybszy do zainstalowania w roślinach C3. Podejmowane są próby zaimplementowania jednokomórkowego systemu fotosyntezy C4 w ryżu (Miyao et al. 2011). Aby wprowadzić jednokomórkową ścieżkę C4-podobną, w której MC wychwytuje i uwalnia CO2 w sposób, w jaki odbywa się to w Hydrilla verticillata (L.f) Royle., cztery enzymy (PEPC, PPDK, NADP-MDH i NADP-ME) zaangażowane w tę ścieżkę zostały nadprodukowane w transgenicznych liściach ryżu (Ku et al. 1999; Fukayama et al. 2001; Tsuchida et al. 2001; Taniguchi et al. 2008). Kilka z głównych napotkanych problemów, które należy rozwiązać, aby stworzyć jednokomórkowy szlak C4-podobny w ryżu to: mechanizm ułatwiający transport PEP przez otoczkę chloroplastu, import OAA do chloroplastów i kierunek reakcji NADP-ME, zaangażowanie NADP-MDH, obecność endogennego PEPC wewnątrz MC chloroplastu ryżu i dalsze podnoszenie aktywności NADP-MDH (Miyao et al. 2011). Lądowe jednokomórkowe gatunki C4, takie jak Bienertia cycloptera, B. sinuspersici i Suaeda aralocaspica, należące do rodziny Chenopodiaceae, również wymagają przestrzennej kompartmentalizacji asymilacji i dekarboksylacji węgla (Chuong et al. 2006). Gatunki te posiadają dimorficzne chloroplasty w tych przedziałach. Wcześniejsze próby daremnych cykli wynikały z braku zmian w anatomii, braku odpowiednich transporterów, a geny kukurydzy transformowane do ryżu nie ulegały odpowiedniej ekspresji w sposób specyficzny dla komórki i nie były regulowane tak jak u kukurydzy, lecz tak jak endogenne ryżowe izoformy C3 (Miyao i in. 2011).

Aby zaprojektować ścieżkę fotosyntezy z C3 do C4 w ciągu dwóch dekad, co w naturze zajęło miliony lat, konsorcjum ryżowe C4 rozpoczęło jednoczesne odkrywanie genów i inżynierię znanych już genów do ryżu w celu stworzenia ryżu C4 o anatomii typu Kranza. Geny C4 takie jak CA, PEPC, PPDK, NADP-ME i NADP-MDH są klonowane z kukurydzy i transformowane do ryżu. Również transportery, które uległy nadmiernej ekspresji w szlakach metabolicznych C4, takie jak transporter 2-oksoglutaranu/malanu (OMT1), transporter dikarboksylanu1 (DiT1), transporter dikarboksylanu2 (DiT2), transporter PEP/fosforanu (PPT1), białko otoczki mezofilu (MEP) i translokator fosforanu triozy (TPT), które zostały ostatnio zidentyfikowane poprzez proteomikę komórek BS i MS kukurydzy (Friso i in. 2010) są obecnie transformowane do ryżu (Rysunek 3). Członkowie konsorcjum ryżowego C4 są również zaangażowani w odkrywanie nowych genów związanych z anatomią Kranza (Wang et al. 2013b). Po przetestowaniu, obiecujące geny kandydujące kontrolujące anatomię Kranza zostaną również wprowadzone do roślin ryżu, które zostały zmodyfikowane z genami szlaku biochemicznego C4.

.