Abstract
Objective. Chociaż wartość wskaźnika Ki-67 w raku piersi została uznana, istnieją również kontrowersje. Celem niniejszej pracy jest wykazanie wartości prognostycznej Ki-67 w zależności od ekspresji receptora progesteronowego (PgR) u chorych na wczesnego raka piersi z dodatnim receptorem estrogenowym (ER-) i ujemnym receptorem 2 ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (HER2-). Metody. Dokonano przeglądu dokumentacji chorych na niemetastatycznego inwazyjnego raka piersi poddanych operacji w jednym ośrodku w latach 2009-2012. Pierwszorzędowym punktem końcowym było przeżycie wolne od nawrotu choroby (RFS), a drugorzędowym punktem końcowym – przeżycie całkowite (OS). Ki-67 i PgR oceniano za pomocą immunohistochemii w guzie pooperacyjnym. Wyniki. Łącznie do badania włączono 1848 chorych. 223 (12%) chorych miało wysoką (≥10%) ekspresję Ki-67, a 1625 (88%) miało niską ekspresję Ki-67. Istotnie gorsze RFS i OS obserwowano w grupie z wysoką vs. niską ekspresją Ki-67 tylko wtedy, gdy PgR był niski (<20%) (i 0,005, odpowiednio, dla RFS i OS). Nie było istotnej różnicy w RFS i OS w zależności od Ki-67, gdy PgR był wysoki ( i 0,076). Porównano RFS czterech grup w zależności od wysokiej/niskiej ekspresji Ki-67 i PgR. Grupa z niskim PgR i wysoką ekspresją Ki-67 wykazywała najgorsze wyniki spośród nich (). W analizie wieloczynnikowej wysokie Ki-67 było niezależnym czynnikiem prognostycznym przy niskim PgR (HR 3,05; 95% CI 1,50-6,19; ). Wnioski. Ki-67 miał wartość jako czynnik prognostyczny tylko przy niskim poziomie ekspresji PgR we wczesnym raku piersi. PgR powinien być brany pod uwagę w ocenie rokowania chorych na raka piersi przy użyciu Ki-67.
1. Wstęp
Prognoza u chorych na raka piersi jest bardzo zmienna i zależy od kilku cech. Raki piersi stanowią heterogenną grupę nowotworów z różnicami histopatologicznymi, immunohistochemicznymi (IHC) i genetycznymi. Charakterystyka kliniczno-histopatologiczna od dawna jest wykorzystywana do oceny rokowania i podejmowania decyzji o planach leczenia. Od tego czasu opracowano metody zastępcze, które wykorzystują powszechnie dostępne testy IHC dla receptora estrogenowego (ER), receptora progesteronowego (PgR), receptora 2 ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (HER2) i Ki-67. Ostatnio informacje genomowe zostały włączone do kliniki w celu przewidywania rokowania w raku piersi i podejmowania decyzji o leczeniu systemowym. Jednakże, z powodu wysokich kosztów i problemów technicznych, testy genetyczne mogą być niedostępne w dużej części świata. Rola biomarkerów jest nadal istotna dla określenia, czy pacjent odniesie korzyść z danego leczenia.
Zwiększona proliferacja jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych i jest istotnym parametrem dla przewidywania odpowiedzi na terapię. Ki-67 jest reprezentatywnym indeksem proliferacyjnym. W wielu badaniach wykorzystano Ki-67 jako przypuszczalny, niezależny marker predykcyjny dla leczenia, mający wartość prognostyczną dla wyniku klinicznego, jak również przeżycia wolnego od choroby i przeżycia całkowitego. Jednak istnieją również kontrowersje dotyczące stosowania Ki-67, z niektórymi badaniami sugerującymi, że Ki-67 nie ma wartości prognostycznej .
Konsensus z Saint Gallen uznał rozróżnienie między guzem „luminalnym A-like” i „luminalnym B-like” i poparł wartość Ki-67 dla solidnej informacji prognostycznej, którą przekazuje . Rozwój analizy wielogenowej umożliwił bardziej wyrafinowane definicje podtypów raka piersi. Pacjentki z guzami luminalnymi A opartymi na IHC w grupie z niskim PgR miały znacznie gorsze przeżycie wolne od choroby niż te w grupie z wysokim PgR. Poprzednie badanie wykazało, że 51,3% guzów IHC luminalnych A z ekspresją PgR ≤20% mieściło się w wewnętrznej klasyfikacji luminalnej B, a tylko 30,9% guzów IHC luminalnych B z ekspresją PgR >20% było rzeczywiście wewnętrznymi guzami luminalnymi B . Tak więc, oparta na PgR klasyfikacja IHC podtypów luminalnych stosowana klinicznie jest nieco niedokładna, a połączenie tej klasyfikacji z ekspresją Ki-67 może poprawić dokładność diagnostyczną.
Celem tego badania było wyjaśnienie niezależnej wartości prognostycznej określania ekspresji Ki-67. W tym celu zbadaliśmy związek między poziomami ekspresji Ki-67 i PgR w praktyce klinicznej i skorelowaliśmy ekspresję tych markerów ze zmiennymi kliniczno-patologicznymi.
2. Materiały i metody
2.1. Study Population
Zebrano retrospektywnie dane 1848 pacjentek z potwierdzonym patologicznie inwazyjnym rakiem piersi, które poddano operacji w Department of Surgery, Seoul National University Hospital (SNUH; Seul, Korea Południowa), między lipcem 2009 a grudniem 2012 roku. Do badania włączono pacjentki z ER-dodatnim i HER2-ujemnym rakiem piersi, niezależnie od statusu PgR. Wykluczono pacjentki z rozpoznaniem raka in situ lub przerzutami odległymi przy pierwotnej diagnozie lub które wcześniej miały operację z powodu raka piersi, a także te, dla których dane dotyczące PgR lub Ki-67 były niedostępne. Nie wykluczano chorych, u których stosowano neoadjuwantową terapię systemową. Analizę IHC wykonywano z tkanki pochodzącej z biopsji rdzeniowej w miejscu rozpoznania. Jeśli informacje z tkanek wyjściowych były niewystarczające, u chorych, u których nie stosowano neoadjuwantowego leczenia systemowego, stosowano wycinki stałe. Tkanki biopsyjne uzyskano od chorych, u których przed leczeniem zastosowano neoadiuwantowe leczenie systemowe. Populację badaną stanowiły chore z rozpoznaniem w stopniu zaawansowania od I do IIIC według patologicznego systemu stagingowego AJCC (American Joint Committee on Cancer, 8th edition). Wznowy dzielono na lokoregionalne i odległe. W tym badaniu do kategorii nawrotów nie zaliczano nawrotów kontralateralnych. Pierwszorzędowym punktem końcowym było przeżycie wolne od nawrotu (RFS) w zależności od stanu ekspresji Ki-67 i PgR. Okres obserwacji odpowiadał czasowi od operacji do ostatniej daty wizyty w szpitalu, niezależnie od odwiedzanego oddziału. Drugorzędowym punktem końcowym było przeżycie całkowite (overall survival – OS). W celu przeprowadzenia obserwacji dokonano przeglądu elektronicznej dokumentacji medycznej pacjentów do listopada 2015 roku; zgony rejestrowano na podstawie raportów od grudnia 2013 roku. RFS podzielono na cztery grupy w oparciu o korelacje z ekspresją Ki-67 i PgR.
2.2. Procedura IHC
Ekspresję receptorów hormonalnych, PgR, HER2 i Ki-67 określono metodą IHC w utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie blokach tkanek. Poziomy ekspresji receptorów hormonalnych, HER2 i Ki-67 oceniano przy użyciu techniki kompleksu awidyna-biotyna. Tkanki pocięto na odcinki o grubości 4 μm, poddano deparafinacji ksylenem, rehydratacji za pomocą stopniowanej serii etanolu i zanurzono w soli fizjologicznej buforowanej Tris. Reprezentatywne sekcje zostały poddane barwieniu immunologicznemu, a ponad 10 pól widzenia o dużej mocy zostało losowo wybranych i zbadanych pod mikroskopem optycznym. Po odzyskaniu antygenu, sekcje inkubowano z przeciwciałami pierwotnymi przeciwko ER (1DO5; Dako, Dania; 1 : 50), PgR (PgR636; Dako; 1 : 50), HER2 (CB11; Novocastra Laboratories, upon-Tyne, Wielka Brytania; 1 : 200) i Ki-67 (MIB-1; Dako; 1 : 800) we wskazanych rozcieńczeniach. Następnie sekcje inkubowano z biotynylowanym anty-mysim przeciwciałem drugorzędowym i barwiono przy użyciu peroksydazy chrzanowej streptawidyny (Zymed Laboratories, San Francisco, CA, USA). Wycinki były barwione hematoksyliną Mayera, odwadniane, oczyszczane, a następnie montowane do badań. Próbki IHC były analizowane przez jednego doświadczonego patologa w SNUH. Wartością odcięcia użytą do określenia niskiej i wysokiej ekspresji Ki-67 była obecność immunoreaktywności Ki-67 w więcej niż 10% wybarwionych jąder w tkankach guza. Stwierdzono, że 10% wartość odcięcia dla Ki-67 ma najlepszą wartość predykcyjną dla rokowania w SNUH. Pacjenci zostali podzieleni na guzy z niską (<20%) i wysoką (≥20%) ekspresją PgR. Wartość odcięcia PgR wynosząca 20% została ustalona na podstawie wyników Międzynarodowej Konferencji Raka Piersi w Saint Gallen w 2013 r.
2.3. Analiza statystyczna
Pacjentki podzielono na grupy o niskim i wysokim Ki-67 oraz na grupy o niskim i wysokim PgR. Charakterystykę kliniczno-patologiczną oceniano za pomocą wszystkich porównań parami grup. Zmienne kategoryczne porównywano za pomocą testu chi kwadrat lub dokładnego testu Fishera. Test t-Studenta stosowano do porównania zmiennych ciągłych między dwiema grupami. RFS definiowano jako okres od daty operacji do daty pierwszej obserwacji nawrotu lub daty ostatniej kontroli bez dowodów na nawrót. OS definiowano jako okres od daty operacji do daty zgonu lub ostatniej obserwacji. Wskaźniki przeżycia oceniano metodą Kaplana-Meiera, a różnice między dwiema grupami porównywano testem log-rank. W jedno- i wielowariantowych analizach wskaźników przeżycia stosowano regresję proporcjonalnego ryzyka Coxa z uwzględnieniem różnych czynników. Analizy regresji Coxa wykorzystano do obliczenia współczynników zagrożeń (HR) i 95% przedziałów ufności (CI). Wartości były dwustronne, a istotność statystyczną definiowano jako wartość <0,05. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania SPSS, wersja 21 dla Windows (IBM Corp., Chicago, IL, USA).
3. Wyniki
3.1. Charakterystyka kliniczno-patologiczna pacjentów
Do badania włączono łącznie 1848 pacjentów. Charakterystykę kliniczno-patologiczną analizowanych chorych uzyskano porównując podgrupy o niskiej i wysokiej ekspresji PgR oraz podgrupy o niskiej i wysokiej ekspresji Ki-67. Średni wiek w każdym z podzbiorów wynosił 49-52 lata. Większe raki (>2 cm) częściej charakteryzowały się wysokim Ki-67 () i niskim PgR (). Stopień histologiczny (HG) dychotomizował próbki na niskie i wysokie podgrupy, przy czym stopień 3 jest klasyfikowany jako wysoki, a stopień 1 + 2 jest klasyfikowany jako niski. Próbki węzłowo-dodatnie i wysoko-HG były również identyfikowane w podgrupach o wysokim Ki-67 i niskim PgR. Co znamienne, więcej przypadków z niskim PgR poddano chemioterapii neoadjuwantowej, niezależnie od statusu Ki-67. Ponadto, więcej chorych z wysokim Ki-67 poddano chemioterapii adiuwantowej, niezależnie od statusu PgR. Uwzględniliśmy również charakterystykę guza w zależności od metody operacyjnej. W sumie 719 pacjentek poddano mastektomii, przy czym większa liczba tych pacjentek miała niską ekspresję PgR niż wysoką ekspresję PgR. Nie stwierdzono natomiast istotnego związku między podzbiorami Ki-67 a częstością wykonywania mastektomii. Jedynie podzbiory PgR różniły się istotnie pomiędzy typami operacji w obrębie pachy. Wznowa, miejscowa lub odległa, wystąpiła u 52 chorych. Wznowa była miejscowa w 10 przypadkach i odległa w 42 przypadkach. Wyniki dotyczące śmiertelności są oparte na publicznych danych z Ministerstwa Spraw Wewnętrznych; od 2013 roku (ostatni rok, dla którego zbadano dane dotyczące śmiertelności), 11 pacjentów zmarło (Tabela 1).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
PgR: receptor progesteronu, IDCa: inwazyjny rak przewodowy, ILCa: inwazyjny rak zrazikowy i LN: węzeł chłonny. Wyniki leczenia chorych w zależności od ekspresji Ki-67 i PgR.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
RFS był znamiennie lepszy dla pacjentów w grupie o niskiej ekspresji Ki-67 niż dla pacjentów w grupie o wysokiej ekspresji Ki-67 (; Rycina 1(a)). RFS był również istotnie lepszy dla grupy z wysoką ekspresją PgR niż dla grupy z niską ekspresją PgR (; Rycina 1(b)).
(a)
(b)
(a)
(b)
Co ciekawe, analiza podzbiorów wykazała, że RFS w oparciu o status ekspresji Ki-67 był znacząco różny w podzbiorze o niskim PgR, ale nie w podzbiorze o wysokim PgR. W szczególności, RFS pacjentów z wysoką ekspresją Ki-67 i niską ekspresją PgR (<20%) było gorsze niż w grupie z niską ekspresją Ki-67 i niską ekspresją PgR (; Figura 2(a)). Przeciwnie, wśród pacjentów w grupie o wysokiej ekspresji PgR (≥20%) nie było istotnej różnicy między grupami o wysokiej i niskiej ekspresji Ki-67 (; Figura 2(b)).
(a)
(b)
(a)
(b)
RFS analizowano dalej, korelując go z podgrupami podzielonymi na cztery grupy na podstawie ekspresji Ki-67 i PgR. Pacjenci z niską ekspresją PgR i wysoką ekspresją Ki-67 wykazywali najgorsze wyniki w porównaniu z pozostałymi trzema grupami (; Rycina 3).
Multivariate Cox regression models showed that Ki-67 was not significantly associated with high PgR expression status, after adjusting for factors including Ki-67 expression group, age, tumor size, nodal status, and HG (HR 2.03; 95% CI 0.61-6.72; ; Table 2). U chorych z podgrupy low PgR ekspresja Ki-67 była istotnie związana z RFS (HR 3,05; 95% CI 1,50-6,19; ; tab. 2). Wielkość guza była istotnie statystycznie związana z RFS w obu statusach PgR.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Analiza drugorzędowego punktu końcowego, OS, podobnie wykazała lepsze przeżycie w podgrupie o niskim Ki-67 z niską ekspresją PgR (; Figura 4(a)) i brak istotnej różnicy w OS między podgrupami Ki-67 w grupie o wysokim PgR (; Figura 4(b)).
(a)
(b)
(a)
(b)
Średni czas przeżycia wolnego od choroby wynosił 70 miesięcy w podgrupie o niskim PgR/wysokim Ki-67 i 75 miesięcy w podgrupie o wysokim PgR/niskim Ki-67. Średni czas przeżycia całkowitego wynosił 74 miesiące i 76 miesięcy, odpowiednio, dla podzbiorów low PgR/high Ki-67 i high PgR/low Ki-67.
4. Dyskusja
Oszacowaliśmy tutaj wartość Ki-67 jako niezależnego czynnika prognostycznego dla nawrotu i przeżycia u chorych na niemetastatycznego raka piersi z guzami ER-dodatnimi i HER2-ujemnymi. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, nasze badanie wykazało, że ekspresja Ki-67 wykazywała znaczącą wartość prognostyczną, ale dodatkowo wykazaliśmy, że Ki-67 nie zawsze jest niezależnym czynnikiem prognostycznym. W szczególności, Ki-67 miał wartość jako czynnik prognostyczny tylko w grupie o niskiej ekspresji PgR. W naszym badaniu porównanie RFS pomiędzy czterema podgrupami ekspresji ujawniło najgorsze rokowanie w podgrupie low PgR high Ki-67. A podgrupa ta liczyła 120 spośród 1848 chorych. W związku z tym aktywne leczenie można rozważyć u około 6% chorych. Jeśli chodzi o przewidywanie rokowania, nasze wyniki sugerują, że połączenie poziomu ekspresji Ki-67 z poziomem ekspresji PgR poprawia wartość predykcyjną. Allison i wsp. wykazali silną korelację pomiędzy wysokim Oncotype DX Recurrence Scores ze stopniem 3 i niską do zanikającej ekspresją PR oraz Ki-67 > 10%. Ponadto Thakur i wsp. wykazali, że wysoki status Ki-67 był istotnie skorelowany z wyższym ryzykiem nawrotu w grupie Oncotype DX (niskie versus wysokie, ) . Jeśli analiza genomowa nie jest dostępna, w przypadku ER-dodatniego i HER2-ujemnego raka piersi można rozważyć pacjentkę z niską ekspresją PgR i wysoką Ki-67 w aktywnym leczeniu. Potrzebne są jednak dalsze prace, w tym niezależna walidacja i być może badanie prospektywne, zanim te ustalenia będą mogły być podjęte w kierunku klinicznego tłumaczenia.
Nasza praca podnosi kilka dodatkowych kwestii. Chociaż Ki-67 jest badany jako marker prognostyczny w raku piersi od ponad dwóch dekad, istnieją kontrowersje dotyczące metod stosowanych do określania jego ekspresji i ogólnej ważności analitycznej opublikowanych wyników. Ważność analityczna odnosi się do zdolności testu do uzyskiwania powtarzalnych i dokładnych wyników. Aby marker miał wartość prognostyczną i predykcyjną, konieczne jest ustalenie „optymalnego” punktu odcięcia, opartego na dowodach naukowych. Dlatego też jedną z przyczyn kontrowersji wokół stosowania Ki-67 jako markera jest brak powszechnie akceptowanej standardowej wartości odcięcia, co spowodowało stosowanie różnych specyficznych wartości progowych przez różne laboratoria. Nasza instytucja wcześniej wykazała, że 10% wartość odcięcia zapewnia najlepsze wyniki prognostyczno-prognostyczne. Wartość ta różni się od wartości cutoff przedstawionej w Konsensusie z Saint Gallen, który w 2011 roku zdefiniował guzy „niskiej proliferacji” jako te z indeksem Ki-67 <14% , cutoff ustalony przez porównanie z wewnętrznym wielogenowym testem molekularnym PAM50 do klasyfikacji raka luminalnego . Podczas konferencji w Saint Gallen w 2013 roku większość panelistów głosowała za podniesieniem progu wskazującego na wysoki status Ki-67 do ≥20%. Ostateczna definicja pojedynczego punktu odcięcia przez konsensus z Saint Gallen pozostała nieuchwytna, ze względu na ciągłą dystrybucję Ki-67 oraz bariery analityczne i przedanalityczne dla standaryzowanej oceny . Punkt odcięcia stosowany przez nasz instytut jest odpowiedni dla naszych badań, ale dyskusje na temat standaryzacji oceny Ki-67 w celu dalszego zmniejszenia zmienności międzyobserwacyjnej będą kontynuowane. Należy przeanalizować, czy wyniki zgłaszane w odniesieniu do wartości prognostycznej Ki-67 byłyby rekapitulowane, gdyby 14% lub 20% było używane zamiast 10%. Kiedy wartość odcięcia Ki-67 została ustalona na 14%, nie było różnicy w zależności od Ki-67. RFS według Ki-67 nie miał istotności statystycznej (; załącznik 1) ani nie wykazywał różnicy między niskim i wysokim Ki-67 według podgrup ekspresji PgR (; załącznik 2a, ; załącznik 2b). Najlepszą strategią jest stosowanie Ki-67 jako markera ciągłego, odzwierciedlającego biologię proliferacji guza. Co więcej, decyzja o leczeniu dla poszczególnych pacjentów nie powinna zależeć od niewielkich różnic Ki-67 wokół danego punktu odcięcia.
Według naszej wiedzy jest to jedno z największych retrospektywnych badań analizujących dane z wysokiej jakości klinicznego rejestru nowotworów na temat rutynowego stosowania i znaczenia prognostycznego Ki-67. Chociaż retrospektywne, ma ono tę zaletę, że obejmuje niewyselekcjonowaną, niemetastatyczną populację raka piersi bez tendencji selekcyjnej. Co ważne, analizy patologii i biomarkerów były wykonywane prospektywnie w jednym, akredytowanym laboratorium, a zatem stanowią „prawdziwą” ocenę wartości IHC w praktyce klinicznej.
Pomimo różnych ograniczeń Ki-67 jako markera, jego kliniczne zastosowanie w raku piersi zostało przyjęte z kilku powodów. Służy on do odróżniania guzów luminalnych i jest uważany za czynnik prognostyczny. Ocena Ki-67 metodą IHC jest niedroga i łatwa do wykonania bez konieczności inwestowania w skomplikowany sprzęt, co prowadzi do atrakcyjnej koncepcji Ki-67 jako taniego biomarkera. Znaczenie elastyczności klinicznej jest fundamentalne, biorąc pod uwagę niepewność związaną z dostosowaniem różnych opcji chemioterapii do każdego przypadku, podkreślając znaczenie ustalenia dokładniejszej roli Ki-67.
W tym badaniu stwierdziliśmy, że Ki-67 jest skutecznym markerem prognostycznym tylko w kontekście niskiego statusu PgR. Stwierdziliśmy również, że pacjenci z niskim PgR i wysoką ekspresją Ki-67 mieli najgorsze rokowanie pod względem RFS. Z perspektywy globalnej, sygnatury genomowe pozostaną trudno dostępne w przewidywalnej przyszłości dla większości pacjentów. Aktywne leczenie można uznać za domyślne w przypadku wczesnego ER-dodatniego i HER2-ujemnego raka piersi, który spełnia warunki niskiego PgR i wysokiego Ki-67.
5. Wnioski
Nasze wyniki wskazują, że Ki-67 ma wartość prognostyczną dla nawrotu i przeżycia u chorych na ER-dodatniego i HER2-ujemnego wczesnego raka piersi tylko w kontekście niskiego poziomu ekspresji PgR. W związku z tym ekspresja PgR powinna być również brana pod uwagę w ocenie rokowania chorych na raka piersi przy użyciu Ki-67.
Dostępność danych
Dane demograficzne i kliniczne zebrane w celu przeprowadzenia analizy statystycznej na poparcie wyników tego badania są dostępne na życzenie u odpowiedniego autora.
Konflikt interesów
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów w związku z publikacją niniejszej pracy.
Materiały uzupełniające
Aplikacja 1: przeżycie wolne od nawrotu choroby (RFS) według indeksu Ki-67 przy wartości odcięcia 14%. Dodatek 2a: przeżycie wolne od nawrotów (RFS) według wskaźnika Ki-67 (wartość odcięcia 14%) w podgrupie o niskim poziomie receptora progesteronowego. Dodatek 2b: RFS według Ki-67 (wartość odcięcia 14%) w podgrupie z wysokim poziomem receptora progesteronowego. (Materiały uzupełniające)
.