1 WPROWADZENIE
Błonki fosfolipidowe (BLM’s) stanowią użyteczny system modelowy do badania podstawowych aspektów składników dwuwarstwy lipidowej biologicznych błon komórkowych, a w szczególności do badania ich właściwości elastycznych. Są to samoorganizujące się struktury amfipatycznych molekuł o właściwościach fizycznych zbliżonych do smektycznych ciekłych kryształów. Matryca dwuwarstwy lipidowej może zawierać zarówno cząsteczki hydrofobowe, jak i amfipatyczne, takie jak białka, inne lipidy, peptydy, steroidy i kosurfaktanty. Właściwości elastyczne membran lipidowych traktowanych jako ośrodki ciągłe są wykorzystywane w wielu badaniach, począwszy od zjawisk lokalnych, takich jak oddziaływania lipid-lipid, lipid-białko i białko-białko, aż po fluktuacje kształtu całych komórek. Ponadto, ciekły węglowodorowy charakter dwuwarstwy jest utrzymywany przez oddziaływania międzycząsteczkowe między fosfolipidami w skali nanoskopowej: oddziaływania elektrostatyczne i dipolowo-dipolowe między polarnymi grupami głównymi, oddziaływania pośredniczone przez cząsteczki wody oraz oddziaływania dyspersyjne van der Waalsa między łańcuchami węglowodorowymi .
Powierzchnie BLM nie są ani idealnie płaskie, ani sztywne. System BLM jest quasi-dwuwymiarową elastyczną strukturą, która przechodzi w sposób ciągły różnorodne przejścia konformacyjne i dynamiczne. Ponadto, sztuczne i naturalne BLM nie są systemami izolacyjnymi, ale przepuszczalnymi dla wody i elektrolitów, które dyfundują przez różnorodne pory transmembranowe.
Stochastyczne pory transmembranowe są generowane przez jeden z następujących mechanizmów: losowe i stronnicze fluktuacje termiczne (termoporacja) oraz wyzwalanie elektryczne (elektroporacja). Cz±steczki lipidów wewn±trz BLM podlegaj± trzem odrębnym kategoriom przypadkowych ruchów termicznych: translacjom bocznym, równoległym do powierzchni dwuwarstwy, ze współczynnikiem dyfuzji bocznej rzędu 10-7 m2s-1 (Dl), oscylacjom i rotacjom wokół osi lipidów prostopadłych do powierzchni dwuwarstwy .
Lokalne translacje o przypadkowych kierunkach wywołuj± lokalne fluktuacje gęsto¶ci polarnych grup głowowych lipidów na powierzchniach dwuwarstwy. Dlatego też, migawka powierzchni dwuwarstwy ujawnia lokalne domeny o wymiarach nanoskopowych z większą gęstością polarnych grup głównych (tj. klastry), jak również strefy o mniejszej gęstości. Dla określonych warunków fizycznych BLM (pH, temperatura, składniki lipidowe, potencjał elektrochemiczny, itp.), te drugie strefy reprezentują małe lokalne defekty (tj. puste przestrzenie) błony. W tych domenach cząsteczki wody mogą penetrować hydrofobową matrycę dwuwarstwy. Rozważmy przypadek dwóch niezależnych defektów z każdej monowarstwy, które s± ustawione w prostopadłym kierunku na powierzchni błony. Mogą one wytworzyć cylindryczny por hydrofobowy, którego wewnętrzna powierzchnia jest flankowana przez hydrofobowe łańcuchy lipidów. Dlatego tego typu pory przejściowe mają charakter hydrofobowy. Możliwe jest również, że polarne grupy główne, znajdujące się w pobliżu hydrofobowej pory, będą podlegały rotacji w kierunku jej wnętrza. W takim przypadku, wewnętrzna hydrofobowa powierzchnia porów zostanie pokryta polarnymi grupami głównymi. W ten sposób pory te mają charakter hydrofilowy, nie mają już cylindrycznej geometrii i charakteryzują się większą stabilnością niż pory hydrofobowe. Innymi słowy, losowe fluktuacje termiczne gęstości polarnych grup funkcyjnych w dwóch monowarstwach BLM są w stanie wygenerować stochastyczne pory transmembranowe.
Występowanie fluktuacji grubości hydrofobowych wewnątrz BLM zostało wykazane zarówno teoretycznie, jak i eksperymentalnie. Zostało to osiągnięte przez określenie wartości grubości warstwy bilateralnej (h) z trzech niezależnych procedur: pomiarów pojemności elektrycznej (hc), pomiarów reflektancji optycznej (hr) i obliczeń bezpośrednich (hav). Tanford (1980) obliczył grubość warstwy dwuwarstwy przy użyciu następującego wzoru hav = Nl M/ρ, gdzie Nl, M i ρ oznaczają odpowiednio liczbę lipidów na jednostkę powierzchni, masę cząsteczkową łańcuchów hydrofobowych i gęstość strefy hydrofobowej. Ze względu na „fluktuacje grubości” obszarów hydrofobowych, hc powinno być równe hav, przy czym w tym przypadku oba powinny być mniejsze od hr o grubość warstwy polarnej (htp): hc ≅ hav = hr-htp. Gdyby dwuwarstwa lipidowa miała jednakową grubość, wówczas hc powinno być równe hav. W przypadku BLM zbudowanej z dwuskładnikowej mieszaniny lipidów, po pojawieniu się domen fosfolipidowych następuje selektywna asocjacja pomiędzy fosfolipidami. Ich grubość jest zależna od długości łańcucha węglowodorowego składników lipidowych. Popescu i wsp. (1991) wykazali powstawanie stochastycznych porów w BLM na skutek fluktuacji grubości warstwy. Wysokość bariery energetycznej dla perforacji błony w takim mechanizmie jest jednak duża (ok. 91 kT, gdzie k i T oznaczają odpowiednio stałą Boltzmanna i temperaturę bezwzględną). W tym przypadku, profil geometryczny porów ma postać eliptyczno-toroidalną. Pokazano również, że taki por transmebranowy może ewoluować do stanu stabilnego. Wyniki uzyskane przez ten model były dość zaskakujące, ze względu na szybką skalę czasową zamykania się porów statystycznych w membranach. Dwa lata później, Zhelev i Needham (1993) stworzyli duże, kwazistabilne pory w pęcherzykach dwuwarstw lipidowych, zachowując tym samym przewidywania poprzedniego modelu. Odporność błony na rozerwanie w kategoriach napięcia liniowego dla dużego porów w pęcherzykach dwuwarstwowych została obliczona przez Moroza i Nelsona (1997) .
Stochastyczne pory transmembranowe mogą być również tworzone przez tendencyjny ruch termiczny lipidów . Ten mechanizm jest czasami nazywany termoporacją. Pory pojawiają się w membranie poprzez termicznie indukowany proces aktywacji. Alternatywnie, proces aktywacji dla tworzenia porów może być indukowany przez zewnętrzne pole elektryczne (zwane również elektroporacją). Pory powstałe w wyniku elektroporacji są większe i bardziej stabilne. Mechanizm elektroporacji został zaproponowany do dostarczania leków i genów do komórek i tkanek.
Pory białkowe transmembranowe są tworzone przez systemy białkowe obejmujące szeroki zakres od małych kanałów peptydowych (np. gramicydyna, alametycyna, melityna itp.) do dużych białkowych kanałów złożonych wielomerycznie. Ponieważ pory te są duże i wypełnione wodą, substancje hydrofilowe, w tym jony, mogą przez nie dyfundować, rozpraszając w ten sposób potencjał elektryczny błony. Transmembranowe pory białkowe składają się z białek integralnych należących do dwóch głównych klas strukturalnych: (1) kanałów selektywnych utworzonych przez wiązane transmembranowe struktury a-helikalne oraz (2) kanałów selektywnych, porów i porin utworzonych przez monomeryczne (np. OmpG), dimeryczne (np. selektywne kanały Cl-), trimeryczne (np. OmpF) lub multimeryczne transmembranowe struktury ß-barrelowe (np. α-hemolizyny, leukocydyny, cytolizyny) . Dwuwarstwa lipidowa może być stosowana jako system in vitro do badania tych kanałów białkowych, gdy są one odtworzone w funkcjonalną błonę. Ponadto, BLMs mogą być wykorzystywane jako narzędzie do inżynierii białek membranowych i ich zastosowań w biofizyce pojedynczych cząsteczek lub biotechnologii.
W innym przykładzie, kolicyna Ia, białko wydzielane przez Escherichia coli, tworzy napięciowe kanały jonowe zarówno w wewnętrznej błonie bakterii docelowych, jak i w planarnych BLMs. Kolicyna Ia jest transporterem błonowym należącym do klasy toksyn bakteryjnych, które mają tę samą strategię: są one wprowadzane do błony innych bakterii konkurujących o składniki odżywcze, tworząc w ten sposób pory o dużych wymiarach. Pory te uszkadzają potencjał elektrochemiczny błony i ostatecznie powodują śmierć konkurujących bakterii. W porównaniu z wyżej wymienionymi porami stochastycznymi, pory białkowe mają inny mechanizm powstawania, a także inne właściwości. Podczas gdy por stochastyczny „zapomina” swój mechanizm powstawania, niektóre z transmembranowych porów białkowych (np. kolicyna Ia) wydają się wykazywać efekty „pamięci”, przynajmniej pod wpływem określonej sekwencji impulsów stosowanych do stymulacji elektrycznej BLM .
Pory genetyczne napotkano w ścianie naczyń sinusoidalnych z wątroby ssaków. Komórki śródbłonka tych naczyń mają liczne pory w postaci płytek sitowych . Pory te o średnicy około 0,1 μm umożliwiają przedostawanie się części osocza krwi i chylomikronów z przestrzeni sinusoidalnej do przestrzeni Disse. Dlatego też pory śródbłonka kontrolują wymianę płynów, rozpuszczalników i cząsteczek między zatokami krwi a przestrzenią Disse .
W tej pracy wykorzystaliśmy teorię sprężystości ośrodków ciągłych do opisania pojawiania się stochastycznych porów przez planarne BLMs.
.