Białko kapsydu głównego P74-26 wykorzystuje unikalne cechy architektoniczne – lassa, pierścienie i płaty – w celu zwiększenia stabilności kapsydu. Obserwujemy wzmocnione interakcje hydrofobowe na interfejsach podjednostka-podjednostka w kapsydzie. Interakcje hydrofobowe są szacowane na >2-krotnie wyższe dla P74-26 niż dla innych mezofilnych homologów (Tabele Uzupełniające 3 i 4). Ta obserwacja może częściowo tłumaczyć zwiększoną termostabilność kapsydu P74-26, ponieważ oddziaływanie hydrofobowe zwiększa swoją siłę w wysokiej temperaturze32. W przeciwieństwie do tego, nie obserwujemy znaczących zmian w liczbie wiązań wodorowych lub mostków solnych (tabele uzupełniające 3 i 4), innych oddziaływań, które zostały zaobserwowane w celu nadania termostabilności dla niektórych białek globularnych33,34,35,36.
Nie byliśmy szczególnie zaskoczeni znalezieniem zwiększonych oddziaływań hydrofobowych w kapsydzie P74-26. Liczne badania termofilnych białek globularnych wykazują zwiększone siły hydrofobowe jako główny czynnik przyczyniający się do stabilności termicznej33,37,38,39,40. Jednakże, są dwie rzeczy, które czynią kapsyd P74-26 unikalnym systemem modelowym: (1) wysokie ciśnienie wewnętrzne z ciasno upakowanego DNA indukuje naprężenia mechaniczne w kapsydzie7,8,27 i (2) jest to struktura samoskładająca się, w której architektura i topologia między podjednostkami odgrywa ważną rolę w ogólnej stabilności. Możemy wyprowadzić te zasady porównując strukturę P74-26 ze strukturą licznych mezofilnych homologów.
Odkryliśmy, że kapsyd P74-26 jest stabilizowany przez kilka pętli i rozszerzeń, które tworzą topologiczne powiązania między podjednostkami. Unikalne lasso pętli E przyłącza się do pętli G i domeny P sąsiedniego MCP, które działają jak zaczep do topologicznego wiązania lassa. Ponadto, ramiona N i C, wraz z ramieniem Dec, całkowicie otaczają pętlę E-, kolejny element architektoniczny unikalny dla P74-26 (ryc. 5e). Tak więc, pętla E jest pierścieniowa w kierunku podstawy i lasso-wana w kierunku wierzchołka.
Drugie lasso jest tworzone przez ramię N, które tworzy oddziaływania zarówno wewnątrz- jak i międzykapsomerowe. Ramię N wiąże się z pętlą E sąsiedniego MCP w obrębie kapsomeru poprzez pasmo górne ramienia, helisę przedramienia i region dłoni (ryc. 5a, c). Ponadto, łokieć, przedramię i dłoń stabilizują interakcje kapsomer-kapsułkomer poprzez wiązanie się z DecP74-26 i podjednostką MCP, która leży w poprzek osi dwu-/quasi-dwukrotnej (ryc. 6a, b). Chociaż ramię N technicznie nie jest zamkniętą pętlą, P74-26 efektywnie zamyka pętlę, wykorzystując unikalną pętlę S do ustalenia pozycji regionów przedramienia i dłoni (ryc. 6c). Nie znajdujemy podobnej architektury lassa na ramieniu N w mezofilnych Caudowirusach31,41,42,43,44,45,46, co sugeruje, że ta architektura jest ważna dla zwiększenia stabilności kapsydu.
Chociaż lassa nie występują w innych Caudowirusach, odległe spokrewnione herpeswirusy zawierają analogiczną architekturę lassa w ramieniu N fałdu HK9747,48,49. Podobnie jak N-ramię P74-26, lassa N-ramienia herpeswirusów nie są prawdziwymi zamkniętymi pętlami. Pomimo tego pozornego podobieństwa, lassa herpeswirusów funkcjonują inaczej. Stabilizują one wyłącznie oddziaływania międzykapsomeryczne, podczas gdy lasso ramienia N P74-26 stabilizuje zarówno oddziaływania wewnątrzkapsomeryczne, jak i międzykapsomeryczne. Ponadto, pentony kapsydów herpeswirusów nie wykazują oddziaływań lasso, a oddziaływania są zmienne w obrębie podjednostek heksonu, podczas gdy P74-26 ma prawie identyczne oddziaływania lasso w obrębie zarówno pentonów, jak i heksonów. Obserwacje te wskazują, że architektura lasso prawdopodobnie ewoluowała niezależnie i podkreślają elastyczność mechanizmów stabilizacji topologicznej. Wysunęliśmy hipotezę, że architektura rozszerzalnych ramion ułatwia ewolucję silniejszych oddziaływań w systemach samoskładających się, takich jak kapsydy. Te otwarte pętle mogą być łatwo wzmocnione przez seryjne wydłużanie pojedynczych reszt. Być może ta łatwość ewolucji jest powodem, dla którego wydłużone ramiona lassos występują zarówno u P74-26, jak i u herpeswirusów. Te przedłużone lassos są podobne do N- i C-końcowych przedłużeń, które pośredniczą w montażu u innych wirusów (np. C-końcowe przedłużenia w białkach płaszcza kapsydu SV4050). Przewidujemy, że tego typu przedłużone lassa mogą być użyteczne w inżynierii bardziej stabilnych kapsydów i innych samoskładających się cząstek.
Inną zaletą architektury lasso jest to, że może ona przyjąć mniej wydłużoną konformację. P74-26 MCP ma dwa lassa na obu końcach fałdu HK97, z których oba są przypuszczalnie obecne w znacznie mniejszym prokapsidzie. Dzięki zastosowaniu tych struktur lassowych, P74-26 może zachować wysoką stabilność, jednocześnie zapewniając elastyczność konformacyjną, umożliwiającą ekspansję podczas dojrzewania. Stawiamy hipotezę, że lassa są mniej wydłużone w prokapsydzie; podczas ekspansji kapsydów lassa osiągają pełne wydłużenie, gdzie blokują się na swoim miejscu. Pełne wydłużenie obserwowane w dojrzałym kapsydzie zapewniłoby integralność naprężeniową, co omówimy poniżej.
P74-26 wykorzystuje przeplatane płaty do topologicznej stabilizacji kontaktów międzykapsomerycznych. Pętla T stabilizuje interakcje międzykapsułowe przez wstawianie się do rowka na P-domenę podjednostki MCP w sąsiednim kapsomerze. Te oddziaływania pętli T występują wzdłuż osi trzykrotnych/quasi-trzykrotnych wzdłuż wewnętrznej strony kapsydów (Rys. 7b; Suplementary Fig. 7b). Podobnie, interkapsomeryczne oddziaływania typu twofold/quasi-twofold są stabilizowane na zewnętrznej stronie kapsydu przez przeplatane ułożenie ramion N (Rys. 7c; Suplementary Fig. 7a). Te zachodzące na siebie struktury przypominają zazębiające się ułożenie klapek w górnej części poruszającego się pudełka. W ten sposób zewnętrzne i wewnętrzne powierzchnie kapsydu są stabilizowane przez dwa oddzielne, przeplatające się oddziaływania klapek. Proponujemy, aby układy ruchomego pudełka widoczne na osiach symetrii i quasi-symetrii znacznie wzmacniały kapsyd przed wewnętrznym ciśnieniem, ponieważ są topologicznie trudne do zakłócenia. Jednakże, te układy są również przypuszczalnie trudne do złożenia, co rodzi ważne pytanie, jak kapsyd P74-26 składa się z przeplataną architekturą.
Białko dekoracyjne P74-26 również przyjmuje unikalny układ strukturalny, przyczyniając się w znacznym stopniu do termostabilności kapsydu. Białka dekoracyjne zwiększają stabilność kapsydu28,29,51, chociaż postuluje się ich dodatkową rolę52. Osie threefold/quasi-threefold są stabilizowane przez trimer DecP74-26. W porównaniu z mezofilnymi Caudowirusami, trimer DecP74-26 oddziałuje z większą liczbą podjednostek na znacznie większym obszarze interakcji (Rys. 8a). Całkowity obszar oddziaływania na podjednostkę DecP74-26 jest dość znaczny: ~4100;Å2 dla 146-rezydowego białka. Nasze poprzednie badania wykazały, że DecP74-26 jest znacznie bardziej stabilny niż jego mezofilne homologi, a stabilizacja ta odbywa się głównie poprzez tworzenie niezwykle ciasnego trimeru23. Jednakże oddziaływania trimeryczne stanowią jedynie niewielką część całkowitej powierzchni interakcji DecP74-26 (~18% całkowitej powierzchni interakcji na podjednostkę DecP74-26). Sugeruje to, że interakcje DecP74-26 z kapsydem przyczyniają się do znacznej stabilności.
Interakcje między trimerami DecP74-26 tworzą klatkę utrzymującą kapsyd razem (ryc. 8b). Ten układ jest unikalny dla P74-26. Na przykład fagi lambda i TW1 używają bardzo podobnej fałdy białka dekoracyjnego23, ale oddziaływanie ich ramienia Dec z innymi białkami kapsydu jest znacznie bardziej ograniczone29,44. Co więcej, niepowiązane białko dekoracyjne faga L nie łączy się z sąsiednimi trimerami, a w rzeczywistości brakuje go na osiach quasi-trójkątów52. Fag T4 jest dekorowany białkiem Soc, które oddziałuje z sąsiednimi podjednostkami Soc na osiach potrójnych i quasi-trójnych; jednak Soc jest obecne w stosunkowo niskim obłożeniu (~50%), więc klatka jest niekompletna41. Ponieważ białka dekoracyjne są zwykle nieobecne w prokapsidzie29, spodziewamy się, że klatka DecP74-26 będzie montowana kooperatywnie po ekspansji kapsydu, aby ustabilizować kapsyd. Przyszłe eksperymenty będą badać rolę kooperatywności w montażu i stabilności.
Ulepszenia architektoniczne w P74-26 MCP i Dec zapewniają stabilizację przed wysokim ciśnieniem wewnętrznym. W jaki sposób siły pochodzące od ciśnienia wewnętrznego działają na kapsyd i jak architektura kapsydów opiera się tym naprężeniom? Jeśli założymy, że ciśnienie od zamkniętego DNA jest równomiernie rozłożone wokół izometrycznego kapsydu, to wszystkie punkty na kapsydzie doświadczają wektora siły, który jest prostopadły do powierzchni kapsydu. Analogicznie, kapsyd doświadcza sił, które są podobne do tych występujących w balonie. Tak więc, ciśnienie wewnętrzne powoduje naprężenia poprzeczne w oddziaływaniach kapsydu. Podczas gdy wysokie ciśnienie wewnętrzne wykazywane przez faga stanowi wyzwanie dla stabilności kapsydu, może ono umożliwić powstanie mechanizmów stabilności, które opierają się na tensegrity. Jest możliwe, że ciśnienie wewnętrzne może być wykorzystane do wytworzenia cząsteczki stabilizowanej przez naprężenia na poszczególnych podjednostkach. Na poparcie tego, kapsydy pikornawirusów, które zmagają się ze znacznie mniejszym ciśnieniem wewnętrznym, mogą być stabilizowane przez niewielkie modyfikacje kapsydu53.
Architektura kapsydu P74-26 jest tak skonstruowana, że wytrzymuje naprężenia boczne przez integralność naprężeniową. Integralność napięciowa, lub tensegrity, jest uogólnionym mechanizmem stabilności architektonicznej, który obejmuje ustrukturyzowane regiony utrzymywane razem przez sieć elastycznych elementów, które są pod ciągłym napięciem54. W kapsydzie P74-26 domeny A i P są regionami strukturalnymi, a lassos i wydłużone ramiona są elementami elastycznymi, które przenoszą napięcie. Na przykład, lasso pętli E będzie napięte w stosunku do zaczepu utworzonego przez pętlę G i domenę P sąsiada. Podobnie, ramię N tworzy lasso, którego koniec jest utrzymywany w miejscu przez pętlę S, która blokuje się w rowku pomiędzy przedramieniem a dłonią (Rys. 6c). Przewidujemy więc, że pętla S będzie wykazywać cechy wiązania typu catch, niekowalencyjnego wiązania, które staje się silniejsze pod wpływem napięcia55. Co więcej, kapsyd P74-26 zawiera kilka płatów, które wzajemnie się przenikają. Te interakcje topologicznie oparłyby się poprzecznym i podłużnym naprężeniom ciśnienia wewnętrznego. Jako całość, te elementy lasso i klapy wykorzystują napięcie, aby oprzeć się strukturalnemu zniszczeniu kapsydu. Mechanizm tensegrity obserwowany tutaj jest po prostu bardziej rozbudowanym przykładem tensegrity kapsydu zasugerowanym przez Caspara wiele lat temu56.
Interakcje lassa, klapy i ramienia są ustawione tak, że ciśnienie wewnętrzne rozkłada naprężenia na wiele wiązań. Na przykład, pętla E arkusza β doświadcza sił wzdłuż osi arkusza. W ten sposób wszystkie wiązania utrzymujące arkusz razem są poddawane naprężeniom, a nie jak w przypadku geometrii ortogonalnej, w której naprężenia dotyczą tylko wiązań na końcu arkusza. Uszkodzenie kapsydu wymagałoby jednoczesnego rozerwania wielu wiązań (geometria ścinania), a nie geometrii rozpinania, w której wiązania pękają jedno po drugim57. Pionierskie badania nad pojedynczymi cząsteczkami wykazały, że geometria ścinania wymaga znacznie większych sił do rozerwania, niż gdy siły działają w geometrii rozpinania58,59,60. Tak więc kapsyd P74-26 jest tak skonstruowany, że siły boczne działają w geometrii ścinania, co skutkuje wysoką tensegrity.
Oprócz unikalnej stabilizującej architektury kapsydu, P74-26 przyjmuje również niekanoniczny mechanizm zmiany pojemności kapsydu. Kapsyd P74-26 jest większy niż u większości Caudovirusów, co koreluje z jego nienormalnie dużym genomem. Większość Caudowirusów T = 7 ma genomy o rozmiarach pomiędzy 30 a 50 kb (Tabela uzupełniająca 2), podczas gdy genom faga P74-26 jest prawie dwukrotnie dłuższy i wynosi 83 kb24. Na podstawie wielkości genomu przewidywaliśmy, że kapsyd będzie T = 12 (średnia wielkość genomu ~80 kb61), choć możliwe byłyby T = 9 lub T = 13 (średnia wielkość genomu odpowiednio ~70 lub ~120 kb). Kapsyd P74-26 osiąga ten większy rozmiar przez znaczne zwiększenie rozmiaru kapsomeru, a nie przez zmianę złożoności ikosaedrycznej. Kapsomer jest większy, ponieważ MCP P74-26 pokrywa większą powierzchnię niż normalnie, pomimo typowej długości dla MCP. W konsekwencji, kapsomer jest nieco cieńszy niż normalnie (Rys. 4b). Tak więc liczba reszt w MCP nie przewiduje całkowitej pokrytej powierzchni, a rozmiar genomu nie przewiduje liczby triangulacji.
Ostatnio Bayfield i wsp.62 określili strukturę blisko spokrewnionego faga termofilnego T = 7, który podobnie wykorzystuje powiększone kapsomery do zwiększenia pojemności kapsydów. Według naszej wiedzy, jest to niekanoniczny mechanizm zwiększania pojemności kapsydu. Istnieją dwa klasyczne mechanizmy powiększania kapsydu: (1) zwiększenie liczby triangulacji i (2) zamiana głowy izometrycznej na prolatynową. W pierwszym przypadku, heksony są dodawane na wszystkich powierzchniach kapsydu, podczas gdy w drugim, heksony są dodawane na dziesięciu powierzchniach ikosaedrycznych, tak że kapsyd wydłuża się w jednym wymiarze (Rys. 9). W obu przypadkach kapsomery pozostają tej samej wielkości. Tutaj zidentyfikowaliśmy trzeci mechanizm ewolucji większego kapsyda: zwiększenie rozmiaru kapsomeru.
Mechanizmy zwiększania pojemności kapsydów. P74-26 przyjmuje nowatorski mechanizm zwiększania pojemności kapsydu poprzez zwiększenie rozmiaru kapsomerów, przy zachowaniu geometrii T = 7
Te trzy mechanizmy mają bardzo różne bariery ewolucyjne. Dwa klasyczne mechanizmy mogą być realizowane poprzez proste mutacje i były wielokrotnie obserwowane. W wielu wirusach proste mutacje punktowe modyfikują liczbę triangulacyjną5,63,64. Ponadto, liczba triangulacji niektórych kapsydów może być zmieniona bez zmiany sekwencji MCP3,65,66. Podobnie, pojedyncze mutacje punktowe u faga T4 przekształcają kapsyd z prolate na izometryczny lub generują olbrzymie głowy, w których długa oś prolate głowy jest wydłużona4,67. Dlatego bariery ewolucyjne dla zmiany objętości kapsydu poprzez te dwa klasyczne mechanizmy wydają się być dość niskie. W przeciwieństwie do tego, zidentyfikowana tutaj strategia powiększania kapsomeru wymaga wielu rozległych zmian w sekwencjach białek kapsydu. Większy kapsyd P74-26 wymaga dużych zmian w ośmiu oddzielnych modyfikacjach struktury MCP, jak również ramienia Dec (Rys. 3a, b i 4c, d). Nasuwa się więc pytanie: dlaczego fag P74-26 wykorzystał tę pozornie trudniejszą strategię ewolucyjną zamiast łatwiejszych, klasycznych strategii? Jakie ograniczenia uniemożliwiły ewolucję większego kapsydu na drodze klasycznej?
Nasza pierwsza hipoteza jest taka, że lassos, klapy i ramiona stabilizujące kapsyd P74-26 wymagają większego kapsomeru do funkcjonowania. Jest możliwe, że lassos potrzebują dodatkowej przestrzeni, aby otworzyć się wystarczająco dla struktury zaczepu, aby wstawić. Podobnie, płaty i ramiona mogą wymagać pewnej długości, aby wywołać swoją stabilizującą aktywność. Gdyby tak było, to elementy architektoniczne stabilizujące kapsyd wymagają większych niż normalnie kapsomerów. W tym scenariuszu większy kapsomer jest wybraną cechą strukturalną, a geometria T = 7 jest spandrelem: biologiczną strukturą, która jest raczej produktem ubocznym ewolucji niż wynikiem bezpośredniej selekcji68. Jednak nie faworyzujemy tej hipotezy, ponieważ lassos występują w herpeswirusach, w których fałd HK97 jest typowym rozmiarem (Herpeswirusowe MCP mają kilka innych domen wieżowych, które zwiększają rozmiar, ale te domeny nie są częścią głównego piętra kapsydów i nie przyczyniają się do fałdu HK9749). Co więcej, inne MCP Caudovirusów zawierają długie ramiona N (np. fag Sf631) lub pętle E, które są otwarte prawie tak szeroko jak P74-26 (np. fag P2243), ale białka te mają typowy rozmiar. Niemniej jednak, hipoteza ta pozostaje niesprawdzona.
Druga hipoteza jest taka, że rozmiar genomu i pojemność kapsydów współewoluowały przez małe równoczesne wzrosty. Jeśli fag ancestralny ewoluował z nieco większym genomem niż można zmieścić w kapsydzie, to może istnieć presja selekcyjna na nieco większy kapsyd. Zwiększenie liczby T lub przejście na głowę prolate znacznie zwiększa objętość kapsydu, powodując duże spadki ciśnienia wewnętrznego. Takie zmiany mogą być zniechęcające, ponieważ ciśnienie wewnętrzne musi być utrzymane dla infekcji26. Aby uniknąć dużych zmian ciśnienia wewnętrznego, większe kapsomery mogą powoli koewoluować z większym genomem.
Naszą ostatnią hipotezą jest to, że geometria kapsydów ma bezpośredni wpływ na ogólną stabilność kapsydów. Postawiliśmy hipotezę, że geometria T = 7 jest z natury bardziej stabilna niż wyższe liczby triangulacji z powodu zmiennych konformacji heksonów. Wszystkie kapsydy o geometrii T = 9 lub wyższej mają więcej niż jeden typ heksonu, podczas gdy wszystkie kapsydy T ≤ 7 mają dokładnie jeden typ heksonu (z wyjątkiem T = 1, który nie ma heksonów69,70). Na przykład, T = 7 ma konformację heksonu z pojedynczym puklerzem, podczas gdy T = 9 ma zarówno heksony skrzydlate, jak i płaskie (Supplementary Fig. 11a, b). Zauważamy również, że kapsydy prolate mają wiele typów heksonów (generalnie trzy lub więcej konformacji heksonów; Rys. 9). Tak więc, główne białka kapsydu w wirusach T > 7 muszą pomieścić heterogeniczność konformacyjną heksonu, co może negatywnie wpływać na stabilność.
Postawiliśmy hipotezę, że geometria T = 7 jest najwyższą złożonością (tj. największy rozmiar), która jest z natury stabilna. Bardziej złożone geometrie wprowadziłyby niestabilność przez zmienność w konformacji heksonu. Ta nieodłączna niestabilność może wymagać dodatkowych mechanizmów stabilizujących, takich jak białka dekoracyjne, które cementują strukturę w miejscu. Przewidujemy dwie niewykluczające się wzajemnie wady geometrii T > 7. Po pierwsze, każda z oddzielnych konformacji heksonu musi pozostać funkcjonalna i stabilna, co ograniczyłoby ewolucję białek MCP w kierunku większej stabilności. Drugą korzyścią jest to, że mniejsza liczba triangulacji skutkuje mniejszą liczbą interfejsów podjednostka-podjednostka, minimalizując w ten sposób liczbę słabych punktów w kapsydzie. Na poparcie tej hipotezy, ekstremofilny, archetypowy wirus HSTV-2 (Halorubrum sodomense tailed virus 2) pakuje swój ~68 kb genom do T = 7 główki71. HSTV-2 wykorzystuje większy niż normalnie kapsyd, a także posiada trimeryczne białka dekoracyjne, które znajdują się na osi trzykrotnej/quasi-trzykrotnej. Fakt, że ten mechanizm powiększania kapsydu został zaobserwowany tylko u ekstremofilów, potwierdza tezę, że geometria T = 7 ma korzystny wpływ na stabilność. W dalszym poparciu naszej hipotezy, wszystkie znane kapsydy T > 7 używają białek dekoracyjnych (według naszej wiedzy), podczas gdy wiele wirusów T = 7 nie posiada białek dekoracyjnych.
Jeśli różne liczby triangulacji mają różną wewnętrzną stabilność, sugerowałoby to, że każda geometria wykazuje słabe punkty w różnych regionach kapsydu, jak zostało to przewidziane w pracy teoretycznej72. Stawiamy hipotezę, że osie threefold/quasi-threefold reprezentują słabe punkty w siatce T = 7. Na poparcie tej hipotezy, białka dekoracyjne T = 7 Caudovirusów są powszechnie spotykane na osiach threefold/quasi-threefold (Tabela uzupełniająca 2)29,44,52. Co więcej, te osie są stabilizowane przez kowalencyjne wiązania krzyżowe w fagach HK9745 i klapy pętli T w P74-26 (ryc. 7b). Aby zbadać tę ideę dalej, zauważamy, że fag T = 9 również używa białek dekoracyjnych na potrójnych osiach73,74, podczas gdy fagi T = 12 i T = 13 używają białek dekoracyjnych w centrach kapsomerów61,75,76.
Zauważamy, że wszystkie nasze analizy koncentrowały się głównie na Caudovirusach. Wirusy te generalnie nie rozkładają swoich kapsydów jako części cyklu życiowego, więc kapsyd nie ma selektywnej presji na bycie labilnym. W rzeczywistości, wysoka presja upakowanego DNA stanowi wysoki nacisk selektywny na ewolucję stabilnych kapsydów. Jest prawdopodobne, że inne typy wirusów wykorzystują inne mechanizmy stabilności, szczególnie wirusy, które rozkładają swoje kapsydy jako niezbędną część cyklu życiowego.
.