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La proteina maggiore del capside P74-26 usa caratteristiche architettoniche uniche: masse, anelli e lembi per migliorare la stabilità del capside. Osserviamo interazioni idrofobiche potenziate alle interfacce subunità-subunità all’interno del capside. Le interazioni idrofobiche sono stimate essere >2 volte superiori per P74-26 rispetto ad altri omologhi mesofili (Tabelle supplementari 3 e 4). Questa osservazione può spiegare in parte la maggiore termostabilità del capside P74-26, come l’effetto idrofobico aumenta in forza ad alta temperatura 32. Al contrario, non osserviamo alcuna alterazione significativa nel numero di legami idrogeno o ponti salini (Tabelle supplementari 3 e 4), altre interazioni che sono state viste per conferire termostabilità per alcune proteine globulari33,34,35,36.

Non siamo stati particolarmente sorpresi di trovare maggiori interazioni idrofobiche nel capside P74-26. Numerosi studi sulle proteine globulari termofile mostrano un aumento delle forze idrofobiche come un importante contributo alla stabilità termica33,37,38,39,40. Tuttavia, ci sono due cose che rendono il capside P74-26 un sistema modello unico: (1) l’alta pressione interna dal DNA strettamente impacchettato induce uno stress meccanico nel capside7,8,27 e (2) è una struttura auto-assemblante in cui l’architettura e la topologia delle inter-subunità gioca un ruolo importante nella stabilità generale. Possiamo ricavare questi principi confrontando la struttura del P74-26 con quelle di numerosi omologhi mesofili.

Abbiamo scoperto che il capside del P74-26 è stabilizzato da diversi loop ed estensioni che formano collegamenti topologici tra le subunità. L’unico lazo E-loop si attacca al G-loop e al dominio P di un MCP vicino, che agiscono come un autostop per legare topologicamente il lazo. Inoltre, i bracci N e C, insieme al braccio Dec, circondano completamente i fili β dell’E-loop, un altro elemento architettonico unico del P74-26 (Fig. 5e). Così, l’E-loop è ad anello verso la base e con un lazo verso la punta.

Un secondo lazo è formato dal braccio N, che forma sia interazioni intra-capsomero che inter-capsomero. Il braccio N si lega all’E-loop di un MCP vicino all’interno di un capsomero attraverso il filamento superiore del braccio, l’elica dell’avambraccio e la regione della mano (Fig. 5a, c). Inoltre, il gomito, l’avambraccio e la mano stabilizzano le interazioni capsomero-capsomero legandosi con DecP74-26 e una subunità MCP che si trova attraverso gli assi biforcati/quasi biforcati (Fig. 6a, b). Mentre il braccio N non è tecnicamente un ciclo chiuso, P74-26 chiude efficacemente il ciclo utilizzando l’unico S-loop per fissare la posizione delle regioni avambraccio e mano (Fig. 6c). Non abbiamo trovato una simile architettura a lazo del braccio N nei Caudovirus mesofili31,41,42,43,44,45,46, il che suggerisce che questa architettura è importante per migliorare la stabilità del capside.

Anche se i lazo non si trovano in altri Caudovirus, gli herpesvirus lontanamente correlati contengono un’analoga architettura a lazo nel braccio N della piega HK9747,48,49. Proprio come il braccio N di P74-26, i lassi del braccio N degli herpesvirus non sono veri e propri anelli chiusi. Nonostante questa apparente somiglianza, i lassi degli herpesvirus funzionano in modo diverso. Essi stabilizzano esclusivamente le interazioni inter-capsomero, mentre il lazo del braccio N di P74-26 stabilizza sia le interazioni intra-capsomero che quelle inter-capsomero. Inoltre, i pentoni dei capidi degli herpesvirus non mostrano interazioni lasso e le interazioni sono variabili all’interno delle subunità esoniche, mentre il P74-26 ha interazioni lasso quasi identiche sia nei pentoni che negli esoni. Queste osservazioni indicano che l’architettura del lazo si è probabilmente evoluta in modo indipendente ed evidenzia la flessibilità dei meccanismi di stabilizzazione topologica. Noi ipotizziamo che l’architettura del braccio estensibile faciliti l’evoluzione di interazioni più forti all’interno di sistemi auto-assemblanti come i capids. Questi cicli aperti possono essere facilmente migliorati attraverso l’estensione seriale di un singolo residuo. Forse questa facilità di evoluzione è il motivo per cui i lassi estesi del braccio si trovano sia nel P74-26 che negli herpesvirus. Questi lassi estesi sono simili alle estensioni N e C-terminali che mediano l’assemblaggio in altri virus (ad esempio le estensioni C-terminali nelle proteine del mantello del capside SV4050). Prevediamo che questi tipi di lasso esteso possono essere utili per l’ingegneria più stabili capids e altre particelle auto-assemblanti.

Un altro vantaggio dell’architettura lasso è che può adottare una conformazione meno estesa. P74-26 MCP ha due lassi alle due estremità della piega HK97, entrambi presumibilmente presenti nel procapside molto più piccolo. Usando queste strutture lasso, P74-26 può mantenere un’alta stabilità, mentre fornisce flessibilità conformazionale per espandersi durante la maturazione. Noi ipotizziamo che i lassi siano meno estesi nel procapside; durante l’espansione del capside, i lassi raggiungono la loro piena estensione, dove si bloccano in posizione. L’estensione completa osservata nel capside maturo fornirebbe l’integrità tensionale, come discutiamo di seguito.

P74-26 usa lembi intrecciati per stabilizzare topologicamente i contatti inter-capsulari. Il T-loop stabilizza le interazioni inter-capsomeriche inserendosi in un solco sul dominio P di una subunità MCP in un capsomero vicino. Queste interazioni T-loop si trovano ad anello sui tre/quasi-tre assi lungo la faccia interna del capside (Fig. 7b; Fig. 7b supplementare). Allo stesso modo, le interazioni inter-capsomeriche bipolari/quasi-due volte sono stabilizzate sulla faccia esterna del capside dalla disposizione interleaved dei bracci N (Fig. 7c; Fig. 7a supplementare). Queste strutture sovrapposte assomigliano alla disposizione interleaved dei lembi nella parte superiore di una scatola mobile. In questo modo, le facce esterne e interne del capside sono stabilizzate da due interazioni separate di lembi intrecciati. Proponiamo che le disposizioni della scatola mobile viste sugli assi di simmetria e quasi-simmetria rafforzino notevolmente il capside contro la pressione interna perché sono topologicamente difficili da interrompere. Tuttavia, queste disposizioni sono anche presumibilmente impegnative da assemblare, il che solleva l’importante questione di come il capside P74-26 si assembli con un’architettura interleaved.

La proteina P74-26 Decoration adotta analogamente una disposizione strutturale unica, contribuendo sostanzialmente alla termostabilità del capside. Le proteine di decorazione aumentano la stabilità del capside28,29,51, sebbene siano stati postulati altri ruoli52. Gli assi triplice/quasi triplice sono stabilizzati dal trimero DecP74-26. Rispetto ai Caudovirus mesofili, il trimer DecP74-26 interagisce con più subunità attraverso un’area di interazione molto più grande (Fig. 8a). L’area totale di interazione per subunità DecP74-26 è abbastanza notevole: ~4100;Å2 per una proteina di 146 residui. Il nostro studio precedente ha dimostrato che DecP74-26 è sostanzialmente più stabile rispetto ai suoi omologhi mesofili, e questa stabilizzazione è principalmente attraverso la formazione di un trimero straordinariamente stretto 23. Tuttavia, le interazioni di trimerizzazione rappresentano solo una piccola frazione dell’area totale di interazione DecP74-26 (~ 18% dell’area totale di interazione per subunità DecP74-26). Questo suggerisce che l’interazione di DecP74-26 con il capside contribuisce ad una quantità sostanziale di stabilità.

Le interazioni tra i trimeri di DecP74-26 formano una gabbia che tiene insieme il capside (Fig. 8b). Questa disposizione è unica per P74-26. Per esempio, i fagi lambda e TW1 usano una proteina di decorazione molto simile23, ma l’interazione del loro braccio Dec con altre proteine del capside è molto più limitata29,44. Inoltre, la proteina di decorazione non correlata del fago L non si connette con i trimeri vicini, e infatti manca agli assi quasi triplici52. Il fago T4 è decorato con la proteina Soc che interagisce con le subunità Soc vicine sugli assi triplice e quasi triplice; tuttavia, Soc è presente in occupazione relativamente bassa (~50%), quindi la gabbia è incompleta41. Poiché le proteine di decorazione sono solitamente assenti nel procapsid29, ci aspettiamo che la gabbia DecP74-26 sarebbe assemblare cooperativamente su espansione capside per stabilizzare il capside. Esperimenti futuri interrogheranno il ruolo della cooperatività nell’assemblaggio e nella stabilità.

I miglioramenti architettonici in P74-26 MCP e Dec forniscono la stabilizzazione contro l’alta pressione interna. Come agiscono le forze della pressione interna sul capside, e come resiste l’architettura del capside a queste sollecitazioni? Se assumiamo che la pressione del DNA incapsulato sia distribuita uniformemente intorno al capside isometrico, allora tutti i punti del capside subiscono un vettore di forza che è perpendicolare alla superficie del capside. Per analogia, il capside sta sperimentando forze che sono simili a quelle di un palloncino. Così, la pressione interna causa sollecitazioni laterali sulle interazioni del capside. Mentre l’alta pressione interna esibita dal fago sfida la stabilità del capside, può consentire meccanismi di stabilità che si basano sulla tensegrità. È possibile che la pressione interna possa essere sfruttata per produrre una particella stabilizzata dallo stress sulle singole subunità. A sostegno di ciò, i capidi dei picornavirus, che si confrontano con una pressione interna considerevolmente inferiore, possono essere stabilizzati da piccole modifiche al capside53.

L’architettura del capside del P74-26 è costruita per resistere allo stress laterale attraverso l’integrità tensionale. L’integrità tensionale, o tensegrità, è un meccanismo generalizzato di stabilità architettonica che coinvolge regioni strutturate tenute insieme da una rete di elementi flessibili che sono sotto continua tensione54. Nel capside P74-26, i domini A e P sono le regioni strutturate e i lassi e i bracci estesi sono gli elementi flessibili che trasmettono la tensione. Per esempio, il laccio E-loop diventerà teso contro il palo formato dal G-loop e dal dominio P del vicino. Allo stesso modo, il braccio N forma un lazo la cui estremità è tenuta in posizione dal cappio S che si blocca nella scanalatura tra l’avambraccio e la mano (Fig. 6c). Quindi, prevediamo che l’S-loop mostrerà le caratteristiche di un legame di cattura, un legame non covalente che diventa più forte sotto tensione55. Inoltre, il capside P74-26 contiene diversi lembi che si intrecciano tra loro. Queste interazioni resisterebbero topologicamente alle sollecitazioni laterali e longitudinali della pressione interna. Nell’insieme, questi elementi lasso e lembi utilizzano la tensione per resistere al cedimento strutturale del capside. Il meccanismo di tensegrità osservato qui è semplicemente un esempio più elaborato di tensegrità del capside suggerito da Caspar molti anni fa56.

Le interazioni tra lazo, lembo e braccio sono posizionate in modo tale che la pressione interna distribuisca lo stress su più legami. Per esempio, il foglio β dell’E-loop sperimenta forze lungo l’asse del foglio. Così, tutti i legami che tengono insieme il foglio sono sotto stress piuttosto che la geometria ortogonale in cui lo stress è solo sui legami all’estremità del foglio. La rottura del capside richiederebbe la rottura simultanea di molti legami (una geometria di taglio), piuttosto che una geometria di apertura in cui i legami si rompono uno alla volta57. Studi pionieristici su singole molecole hanno dimostrato che una geometria di taglio richiede forze molto più elevate per rompere rispetto a quando le forze agiscono in una geometria di apertura58,59,60. Così, il capside del P74-26 è costruito in modo tale che le forze laterali agiscano in una geometria di taglio, con conseguente elevata tensegrità.

Oltre all’architettura unica di stabilizzazione del capside, il P74-26 adotta anche un meccanismo non canonico per modificare la capacità del capside. Il capside di P74-26 è più grande che nella maggior parte dei Caudovirus, il che è correlato al suo genoma anormalmente grande. La maggior parte T = 7 Caudovirus hanno dimensioni del genoma tra 30 e 50 kb (Tabella supplementare 2), mentre il genoma del fago P74-26 è quasi il doppio della lunghezza a 83 kb24. Sulla base delle dimensioni del genoma avevamo previsto che il capside sarebbe stato T = 12 (dimensione media del genoma ~80 kb61), anche se T = 9 o T = 13 sarebbe stato possibile (dimensione media del genoma ~70 o ~120 kb, rispettivamente). Il capside P74-26 raggiunge questa dimensione maggiore aumentando significativamente la dimensione del capsomero piuttosto che cambiando la complessità icosaedrica. Il capsomero è più grande perché l’MCP del P74-26 copre più superficie del normale, nonostante la lunghezza tipica dell’MCP. Di conseguenza, il capsomero è leggermente più sottile del normale (Fig. 4b). Quindi, il numero di residui in MCP non predice l’area totale coperta, e la dimensione del genoma non predice il numero di triangolazione.

Di recente, Bayfield et al.62 hanno determinato la struttura di un fago termofilo strettamente correlato T = 7, che similmente utilizza capsomeri ingranditi per aumentare la capacità del capside. A nostra conoscenza, questo è un meccanismo non canonico per aumentare la capacità del capside. Ci sono due meccanismi classici per ingrandire un capside: (1) l’aumento del numero di triangolazione e (2) la conversione di una testa isometrica in prolata. Nel primo caso, gli esoni sono aggiunti attraverso tutte le facce del capside, mentre nel secondo, gli esoni sono aggiunti attraverso dieci delle facce icosaedriche in modo che il capside sia allungato in una dimensione (Fig. 9). In entrambi i casi, i capsomeri rimangono della stessa dimensione. Qui, abbiamo identificato un terzo meccanismo per l’evoluzione di un capside più grande: l’aumento delle dimensioni del capsomero.

Questi tre meccanismi hanno barriere evolutive molto diverse. I due meccanismi classici possono essere implementati attraverso semplici mutazioni e sono stati osservati numerose volte. In molti virus, semplici mutazioni puntiformi modificano il numero di triangolazione5,63,64. Inoltre, il numero di triangolazione di alcuni capside può essere alterato senza cambiare la sequenza MCP3,65,66. Allo stesso modo, singole mutazioni puntiformi nel fago T4 convertono il capside da prolato a isometrico o generano teste giganti in cui l’asse lungo della testa prolata è allungato4,67. Pertanto, le barriere evolutive per l’alterazione del volume del capside attraverso i due meccanismi classici sembrano essere piuttosto basse. Al contrario, la strategia del capsomero allargato identificata qui richiede alterazioni multiple ed estese alle sequenze delle proteine del capside. Il capside più grande del P74-26 richiede grandi cambiamenti alle otto modifiche separate alla struttura MCP, così come al braccio Dec (Figg. 3a, b e 4c, d). Questo porta alla domanda: perché il fago P74-26 ha utilizzato questa strategia evolutiva apparentemente più impegnativa piuttosto che le strategie classiche più facili? Quali vincoli hanno impedito l’evoluzione di un capside più grande attraverso le vie classiche?

La nostra prima ipotesi è che i lassi, i lembi e le braccia che stabilizzano il capside P74-26 richiedono un capsomero più grande per funzionare. È possibile che i lassi abbiano bisogno di spazio in più per aprirsi abbastanza da permettere l’inserimento di una struttura a palo d’attacco. Allo stesso modo, i lembi e le braccia possono richiedere una certa lunghezza per suscitare la loro attività stabilizzatrice. Se questo fosse il caso, allora gli elementi architettonici che stabilizzano il capside richiedono capsomeri più grandi del normale. In questo scenario, il capsomero più grande è la caratteristica strutturale selezionata e la geometria T = 7 è uno spandrel: una struttura biologica che è un sottoprodotto dell’evoluzione piuttosto che un risultato della selezione diretta68. Tuttavia, non favoriamo questa ipotesi perché lassos si trovano in herpesviruses, in cui la piega HK97 è una dimensione tipica (Herpesvirus MCPs hanno diversi altri domini torre che aumentano le dimensioni, ma questi domini non fanno parte del piano principale del capside e non contribuiscono alla piega HK9749). Inoltre, altri MCP di Caudovirus contengono lunghi N-arms (per esempio il fago Sf631) o E-loops che sono aperti quasi quanto il P74-26 (per esempio il fago P2243), ma queste proteine sono di dimensioni tipiche. Tuttavia, questa ipotesi rimane non verificata.

Una seconda ipotesi è che la dimensione del genoma e la capacità del capside si siano coevolute attraverso piccoli aumenti concomitanti. Se il fago ancestrale ha sviluppato un genoma leggermente più grande di quello che può essere ospitato nel capside, allora ci può essere una pressione selettiva per un capside leggermente più grande. L’aumento del numero di T o la transizione verso una testa prolata aumenta sostanzialmente il volume del capside, con conseguente grande calo della pressione interna. Queste transizioni possono essere scoraggiate perché la pressione interna deve essere mantenuta per l’infezione26. Per evitare grandi cambiamenti nella pressione interna, capsomers più grande può lentamente coevolvere con un genoma più grande.

La nostra ipotesi finale è che la geometria del capside ha un effetto diretto sulla stabilità complessiva del capside. Noi ipotizziamo che la geometria T = 7 sia intrinsecamente più stabile rispetto ai numeri di triangolazione più alti a causa delle conformazioni variabili degli esoni. Tutti i capside che sono T = 9 o superiore hanno più di un tipo di esone presente, mentre tutti i capside T ≤ 7 hanno esattamente un tipo di esone (tranne T = 1, che non ha esoni69,70). Per esempio, T = 7 ha una conformazione esone singolo-pucker, mentre T = 9 ha sia esoni alato e piatto (Supplementary Fig. 11a, b). Notiamo anche che i capidi prolati hanno più tipi di esoni (generalmente tre o più conformazioni esoniche; Fig. 9). Così, le principali proteine del capside in T > 7 virus deve ospitare l’eterogeneità conformazionale esone, che può influenzare negativamente la stabilità.

Ipotizziamo che T = 7 geometria è la più alta complessità (cioè più grande dimensione) che è intrinsecamente stabile. Geometrie più complesse introdurrebbero instabilità attraverso la variazione della conformazione dell’esone. Questa instabilità intrinseca può richiedere meccanismi di stabilizzazione extra per mitigare, come le proteine di decorazione per cementare la struttura in posizione. Prevediamo due svantaggi non mutualmente esclusivi della geometria T > 7. In primo luogo, ciascuna delle conformazioni separate dell’esone deve rimanere funzionale e stabile, il che vincolerebbe l’evoluzione delle proteine MCP per una maggiore stabilità. Il secondo vantaggio è che un numero inferiore di triangolazioni si traduce in un minor numero di interfacce subunità-subunità, riducendo così al minimo il numero di punti deboli nel capside. A sostegno di questa ipotesi, il virus arcaico estremofilo HSTV-2 (Halorubrum sodomense tailed virus 2) confeziona il suo genoma di ~68 kb in una testa T = 771. HSTV-2 utilizza un capside più grande del normale, e ha anche proteine di decorazione trimeriche che siedono agli assi triplice/quasi triplice. Il fatto che questo meccanismo di allargamento del capside sia stato osservato solo negli estremofili supporta l’idea che la geometria T = 7 abbia un effetto benefico sulla stabilità. A ulteriore sostegno della nostra ipotesi, tutti i noti T > 7 capsidi utilizzano proteine di decorazione (a nostra conoscenza), mentre molti virus T = 7 mancano di proteine di decorazione.

Se vari numeri di triangolazione hanno diversa stabilità intrinseca, questo suggerirebbe che ogni geometria presenta punti deboli in diverse regioni del capside, come è stato previsto dal lavoro teorico72. Noi ipotizziamo che i tre/quasi-tre assi rappresentano i punti deboli in un reticolo T = 7. A sostegno di questa ipotesi, proteine decorazione di T = 7 Caudovirus si trovano comunemente al triplice / quasi-triplice assi (Tabella supplementare 2) 29,44,52. Inoltre, questi assi sono stabilizzati da legami incrociati covalenti in HK97 fago45 e T-loop lembi in P74-26 (Fig. 7b). Per esaminare ulteriormente questa idea, notiamo che T = 9 fago anche utilizzare proteine decorazione agli assi triplice73,74, mentre T = 12 e T = 13 fago utilizzare proteine decorazione ai centri di capsomers61,75,76.

Si noti che tutta la nostra analisi è principalmente focalizzata su Caudovirus. Questi virus generalmente non rompono i loro capisaldi come parte del loro ciclo vitale, quindi il capside non ha alcuna pressione selettiva per essere labile. Infatti, l’alta pressione del DNA impacchettato presenta un’alta pressione selettiva per evolvere capidi stabili. È probabile che altri tipi di virus utilizzino diversi meccanismi di stabilità, in particolare i virus che smontano i loro capidi come parte necessaria del loro ciclo vitale.