Abstract
I meccanismi di acetilazione di diversi substrati tipici selezionati dagli esperimenti, tra cui arilammine e arilidrazine, sono studiati con la teoria funzionale della densità in questo articolo. I risultati indicano che tutti gli stati di transizione sono caratterizzati da una struttura ad anello di quattro membri, e l’idralazina (HDZ) è il substrato più potente. La bioattività per tutti i composti aumenta in una sequenza di PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ. L’effetto di congiunzione e la delocalizzazione delle coppie solitarie dell’atomo N giocano un ruolo chiave nella reazione. Tutti i risultati sono coerenti con i dati sperimentali.
1. Introduzione
Le arilamine N-acetiltransferasi (NATs, EC 2.3.1.5) sono enzimi del metabolismo di fase II che si trovano sia nei procarioti che negli eucarioti. La reazione di N-acetilazione porta alla detossificazione degli xenobiotici arilaminici e infine si dirige verso gli ioni arilnitrenium elettrofili, che sono considerati responsabili della formazione di addotti al DNA. Agli umani, i due isozimi NAT funzionali, NAT1 e NAT2, mostrano grandi differenze nella specificità del substrato e nella distribuzione dei tessuti nonostante l’identità di sequenza aminoacidica dell’81%. Quest’ultimo, NAT2, è espresso prevalentemente nel fegato e nell’epitelio intestinale. Studi precedenti hanno supposto che i NAT catalizzano un trasferimento di acetile con un classico meccanismo cinetico ping-pong (Schema 1). L’analisi di mutagenesi sito-diretta del NAT2 umano e del NAT di Salmonella typhimurium (StNAT) ha suggerito che un residuo di cisteina nel sito attivo fosse responsabile della mediazione del processo di acetilazione. Un recente studio di cinetica presteady-state e steady-state su p-nitrofenil acetato (PNPA) e NAT2 ha rivelato che il meccanismo catalitico di NAT2 potrebbe dipendere dalla formazione di una coppia tiolato-imidazolio. Sebbene l’enzima si trovi sia negli eucarioti che nei procarioti, i ruoli endogeni dei NAT non sono ancora chiari. La determinazione del substrato ha rivelato che sia le arilammine che le arilidrazine potrebbero essere acetilate dai NAT. I passi necessari nella reazione di trasferimento dell’acetile sono composti dal trasferimento del gruppo acetile dal residuo di cisteina del sito attivo al substrato e dalla rimozione di un protone da quest’ultimo al primo. In questo articolo, è disponibile uno studio teorico dettagliato sui comportamenti dei substrati di arilammine e arilidrazine nell’acetilazione, comprese le proprietà delle loro strutture, gli stati di transizione, i profili delle energie.
La reazione di trasferimento di acetile catalizzata dai NAT.
2. Metodologie
Tutti i calcoli sono stati eseguiti con il metodo della teoria funzionale di densità (DFT) B3LYP come implementato nel pacchetto di programmi Gaussian03 , che è stato precedentemente impiegato con successo su una serie di sistemi enzimatici. Quando sono stati utilizzati i set di basi 6-31G* e 6-311+G (3df, 2p), il funzionale ibrido B3LYP è stato preferito ai metodi Hartree-Fock (HF) e MP2. Anche se a volte fallisce nel trattamento delle interazioni ricche di dispersione, il metodo B3LYP è stato applicato con successo a molti sistemi biologici.
Le geometrie di tutti i reagenti, intermedi e prodotti sono ottimizzati al livello teorico B3LYP/6-31G*. Sono state calcolate le conformazioni più stabili e le loro energie ad ogni equilibrio e stati di transizione. I calcoli di frequenza sono stati eseguiti per tutti i punti stazionari risultanti e ogni stato di transizione ha solo una frequenza immaginaria. Inoltre, il metodo MP2/6-311+G** è impiegato sulle strutture ottimizzate dei punti stazionari per ottenere profili energetici più accurati. Se non specificatamente indicato, tutte le seguenti analisi energetiche si riferiscono ai risultati dei calcoli MP2/6-311+G**//B3LYP/6-31G (d).
3. Risultati e Discussione
3.1. Gli obitali di frontiera dei substrati
Sei substrati, acido p-aminobenzoico (PABA), 4-metossilanilina (4-MA), 4-aminosalicilato (4-AS), 5-aminosalicilato (5-AS), isoniazide (INZ), idralazina (HDZ), sono selezionati secondo i riferimenti, che possono essere divisi in due famiglie distinte: arilammine e arilidrazine. Le energie per gli obitali di frontiera (compresi HOMO-2, HOMO-1, HOMO, LUMO, LUMO+1 e LUMO+2) di tutti i sei substrati sono elencati nella tabella 1, che sono considerati giocare ruoli importanti nei sistemi bioenzimatici. Per le arilammine, le energie HOMO sono ridotte in una sequenza di 4-MA > 5-AS > PABA > 4-AS, che indica l’aumento della loro reattività nucleofila. Tra tutti i sei substrati (vedi Figura 1 nei materiali supplementari disponibili online al doi: 10.1155/2009/783035), INZ ha il più grande gap energetico tra HOMO e LUMO, che suggerisce la sua stabilità. I risultati della Natural Population Analysis (NPA) hanno mostrato che gli atomi di amino N attivi per la famiglia delle arilamine sono più elettronegativi di quelli del gruppo delle idrazine, il che è causato principalmente dall’effetto di coniugazione.
Anche se PABA e 4-AS hanno diverse sostituzioni sul sito p- del gruppo amminico sull’anello a sei membri, le loro bioattività sono quasi le stesse. Un legame H intermolecolare stabilizza il substrato stesso con un calo di energia di circa 19-21 kJ/mol. Sia le energie HOMO che LOMO per il 5-AS sono più alte di quelle del 4-A𝑆s, suggerendo che il primo è più reattivo del secondo.
Per i substrati delle arilidrazine, la coppia solitaria degli atomi N alla spina dorsale dell’anello a sei membri sarà delocalizzata in tutto il sistema in modo da aumentarne la stabilità. I valori di 𝐸(𝐿-𝐻)di HDZ è 0,0318 a.u. superiore a quello di INZ, indicando la sua maggiore reattività rispetto a quest’ultimo.
3.2. I diversi percorsi e gli stati di transizione
In linea di principio, tutti i substrati possono reagire con il residuo di cisteina del sito attivo attraverso un percorso concertato o uno stepwise. Nel primo caso, gli stati di transizione (vedi figure 1 e 2, con-ts) sperimentano un trasferimento concertato dell’idrogeno H5 all’atomo S1 della cisteina e la formazione di un legame tra gli atomi N4 e C2. La rottura dei vecchi legami (N4H5 e S1C2) e la formazione di quelli nuovi (C2N4 e S1H5) avvengono simultaneamente. I reagenti e i prodotti target sono collegati dall’unico stato di transizione sulla superficie di energia potenziale (PES). I dati della struttura principale di tutti gli stati di transizione sono elencati nella tabella 1 dei materiali supplementari. Per il meccanismo graduale, l’atomo di H5 sarà prima trasferito all’atomo di O3 del gruppo carbonilico, tendendo a generare un nuovo legame tra l’atomo di N4 e C2 attraverso lo stato di transizione stw-ts1. Poi, si formerà un intermedio tiolestero (intmed). Di conseguenza, la seconda migrazione di H5 avrà luogo dal gruppo idrossile all’atomo S1 tramite stw-ts2 insieme alla rottura del legame S1-C2, che infine dirigerà ai prodotti.
I percorsi concertati e graduali per la reazione catalizzata dalle arilamine N-acetiltransferasi.
(a)
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(d)
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La struttura degli stati di transizione sia per la via concertata che per quella graduale del PABA.
I risultati indicano che tutti gli stati di transizione sono caratterizzati da una struttura ad anello a quattro membri che è quasi planare. Ci sono due piccoli angoli inferiori a 80° in ogni stato di transizione (C2S1H5 e S1C2N4 per i con-ts, C2O3H5 e C2N4H5 per stp-ts1, C2S1H5 e S1C2O3 per stp-ts2), che portano grande tensione all’intero sistema e lo rendono instabile. Tra i sei stati di transizione concertati (con-ts) di tutti i substrati, le proprietà del legame C2N4, N4H5 e S1H5 sono più o meno le stesse per tutti i substrati, mentre l’interazione tra S1 e C2 è uno dei fattori determinanti per il passo concertato.
Le cose diventano diverse per i percorsi stepwise. I cambiamenti di ibridazione dell’atomo C2 seguono una tendenza simile (𝑠𝑝3→𝑠𝑝2→𝑠𝑝3) per tutti i substrati durante l’acetilazione stepwise (tabella 1 supplementare). La prima migrazione di H5 porterà allo stato di transizione stp-ts1, e poi un intermedio chiamato intmed si trova sulla superficie di energia potenziale (PES), che è un minimo locale. Si tratta di un intermedio tiolestero tetraedrico come proposto in precedenti studi sperimentali. È di breve durata e un conseguente trasferimento di H5 avverrà presto attraverso lo stato di transizione stp-ts2. Per il percorso graduale, le strutture degli stati di transizione per diversi substrati differiscono molto poco con altri. Le strutture 3D degli stati di transizione sono state elencate per il PABA (Figura 2), le altre erano simili a quelle.
3.3. Le energie
Le energie relative di tutti i percorsi possibili per i sei substrati sono effettuate sulla base della somma energetica dei reagenti presa come zero (Figura 3). Dalla figura 3, troviamo che i percorsi concertati sono preferiti a quelli graduali. Le barriere energetiche degli stati di transizione concertati (con-ts) sono inferiori a quelle di quelli stepwise (stp-ts1) in un range di 83,5 kJ/mol a 26,9 kJ/mol (Tabella 2 supplementare). Le arilidrazine sono substrati migliori delle arilammine, e HDZ è il più reattivo con la più bassa energia di attivazione, che soddisfa i dati sperimentali con un buon accordo. Questa conclusione potrebbe essere tratta anche dall’analisi dei dati di struttura (tabella 1 supplementare). L’effetto di congiunzione potenziato e la delocalizzazione delle coppie solitarie di azoto alla spina dorsale hanno stabilizzato lo stato di transizione. La bioattività per tutti i substrati è aumentata in una sequenza di PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ.
I profili energetici per tutti i substrati. (i)Tutti i substrati possono essere acetilati attraverso due vie diverse: quella concertata e quella graduale, e la prima è molto preferita a causa delle energie di attivazione più basse.(ii)Dai nostri calcoli, le arilidrazine sono substrati migliori delle arilammine, e HDZ è la più reattiva con la più bassa energia di attivazione. La bioattività per tutti i substrati è aumentata in una sequenza come PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ, che è coerente con i risultati sperimentali molto bene. (iii) L’effetto congiunzione e le coppie solitarie delocalizzate giocano ruoli molto importanti nell’acetilazione. L’effetto di congiunzione potenziato e l’aumento del numero di coppie solitarie sull’anello a sei membri porteranno a una barriera energetica più bassa.
Riconoscimenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Natural Scientific Foundation of China (no.20603030, no.20873074, e no.10674114), il progetto 973 del Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (n. 2009CB930103), la Fondazione Scientifica Naturale della Provincia di Shandong (n. Q2008B07), e la Fondazione per Gruppi di Ricerca Creativa dell’Università di Ludong (n. 08-CXA001).
Materiale supplementare
Per la limitazione della lunghezza di questo documento, le strutture 3D di tutte le arilammine e i substrati delle arilidrazine, i dati della struttura principale per tutti gli stati di transizione e le energie relative per i diversi percorsi sono stati raccolti nel materiale supplementare.