Abstract
Les mécanismes d’acétylation de plusieurs substrats typiques sélectionnés à partir d’expériences, y compris les arylamines et les arylhydrazines, sont étudiés avec la théorie fonctionnelle de la densité dans cet article. Les résultats indiquent que tous les états de transition sont caractérisés par une structure cyclique à quatre chaînons, et que l’hydralazine (HDZ) est le substrat le plus puissant. La bioactivité de tous les composés est augmentée dans une séquence de PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ. L’effet de conjonction et la délocalisation des paires solitaires de l’atome N jouent un rôle clé dans la réaction. Tous les résultats sont cohérents avec les données expérimentales.
1. Introduction
Les arylamine N-acétyltransférases (NATs, EC 2.3.1.5) sont des enzymes du métabolisme de phase II que l’on retrouve à la fois chez les procaryotes et les eucaryotes . La réaction de N-acétylation conduit à la détoxification des xénobiotiques arylaminés et se dirige finalement vers les ions arylnitrenium électrophiles, qui sont considérés comme responsables de la formation d’adduits à l’ADN. À l’heure actuelle, les deux isoenzymes fonctionnels du NAT, le NAT1 et le NAT2, présentent de grandes différences en termes de spécificité du substrat et de distribution tissulaire, malgré une identité de séquence d’acides aminés de 81 %. Le dernier, NAT2, est exprimé principalement dans le foie et l’épithélium intestinal. Des études antérieures ont supposé que les NATs catalysent un transfert d’acétyle par un mécanisme cinétique classique de type ping-pong (schéma 1). L’analyse par mutagenèse dirigée du NAT2 humain et du NAT de Salmonella typhimurium (StNAT) a suggéré qu’un résidu cystéine dans le site actif était responsable de la médiation du processus d’acétylation. Des études récentes de cinétique à l’état présteady et à l’état stable sur l’acétate de p-nitrophényle (PNPA) et le NAT2 ont révélé que le mécanisme catalytique du NAT2 pourrait dépendre de la formation d’une paire thiolate-imidazolium. Bien que l’enzyme soit présente à la fois chez les eucaryotes et les procaryotes, les rôles endogènes des NATs ne sont toujours pas clairs. La détermination du substrat a révélé que les arylamines et les arylhydrazines pouvaient être acétylées par les NATs. Les étapes nécessaires à la réaction de transfert d’acétyle sont composées du transfert du groupe acétyle du résidu cystéine du site actif au substrat, et de l’élimination d’un proton de ce dernier au premier. Dans cet article, une étude théorique détaillée sur les comportements des substrats arylamines et arylhydrazines dans l’acétylation est disponible, y compris les propriétés de leurs structures, les états de transition, les profils des énergies.
La réaction de transfert d’acétyle catalysée par les NATs.
2. méthodologies
Tous les calculs ont été effectués avec la méthode de théorie fonctionnelle de la densité (DFT) B3LYP telle qu’implémentée dans le paquet de programmes Gaussian03 , qui a été précédemment employée avec succès sur un certain nombre de systèmes enzymatiques . Lorsque les ensembles de base 6-31G* et 6-311+G (3df, 2p) ont été utilisés, la fonction hybride B3LYP a été préférée aux méthodes Hartree-Fock (HF) et MP2. Bien qu’elle échoue parfois dans le traitement des interactions riches en dispersion, la méthode B3LYP a été appliquée avec succès sur de nombreux systèmes biologiques .
Les géométries de tous les réactifs, intermédiaires et produits sont optimisées au niveau de théorie B3LYP/6-31G*. Les conformations les plus stables ainsi que leurs énergies à chaque équilibre et aux états de transition ont été déterminées. Des calculs de fréquence sont effectués pour tous les points stationnaires résultants et chaque état de transition n’a qu’une seule fréquence imaginaire. De plus, la méthode MP2/6-311+G** est employée sur les structures optimisées des points stationnaires pour obtenir des profils énergétiques plus précis. Si ce n’est pas spécialement indiqué, toutes les analyses énergétiques suivantes font référence aux résultats des calculs MP2/6-311+G**//B3LYP/6-31G (d).
3. Résultats et discussion
3.1. Les obitaux frontières des substrats
Six substrats, l’acide p-aminobenzoïque(PABA), la 4-méthoxylaniline(4-MA), le 4-aminosalicylate (4-AS), le 5-aminosalicylate(5-AS), l’isoniazide(INZ), l’hydralazine (HDZ), sont sélectionnés selon les références , qui peuvent être divisés en deux familles distinctes : les arylamines et les arylhydrazines. Les énergies pour les obitaux frontières (incluant HOMO-2, HOMO-1, HOMO, LUMO, LUMO+1 et LUMO+2) des six substrats sont listés dans le tableau 1, qui sont considérés comme jouant des rôles importants dans les systèmes bioenzymatiques . Pour les arylamines, les énergies HOMO sont réduites dans une séquence de 4-MA > 5-AS > PABA > 4-AS, ce qui indique l’augmentation de leur réactivité nucléophile. Parmi les six substrats (voir la figure 1 dans les documents supplémentaires disponibles en ligne à l’adresse suivante : doi : 10.1155/2009/783035), l’INZ présente le plus grand écart énergétique entre HOMO et LUMO, ce qui suggère sa stabilité. Les résultats de l’analyse des populations naturelles (APN) ont montré que les atomes N aminés actifs pour la famille des arylamines sont plus électronégatifs que ceux du groupe des hydrazines, ce qui est principalement causé par l’effet de conjugaison.
Bien que le PABA et le 4-AS aient des substitutions différentes sur le site p- du groupe amino au niveau du cycle à six chaînons, leurs bioactivités sont presque les mêmes. Une liaison H intermoléculaire stabilise le substrat lui-même avec une chute d’énergie d’environ 19-21 kJ/mol. Les énergies HOMO et LOMO du 5-AS sont plus élevées que celles du 4-A𝑆s, ce qui suggère que le premier est plus réactif que le second.
Pour les substrats arylhydrazines, le couple solitaire des atomes N au niveau du squelette du cycle à six chaînons sera délocalisé au niveau de l’ensemble du système de manière à renforcer sa stabilité. Les valeurs 𝐸(𝐿-𝐻)de HDZ sont 0,0318 u.a. plus élevées que celles de INZ, ce qui indique sa réactivité plus élevée que cette dernière.
3.2. Les différentes voies et les états de transition
En principe, tous les substrats peuvent réagir avec le résidu cystéine du site actif par une voie concertée ou par étapes. Dans le premier cas, les états de transition (voir figures 1 et 2, con-ts) connaissent un transfert concerté de l’hydrogène H5 vers l’atome S1 de la cystéine et une formation de liaison entre les atomes N4 et C2. La rupture des anciennes liaisons (N4H5 et S1C2) et la formation de nouvelles liaisons (C2N4 et S1H5) ont lieu simultanément. Les réactifs et les produits cibles sont reliés par le seul état de transition sur la surface d’énergie potentielle (PES). Les principales données de structure de tous les états de transition sont répertoriées dans le tableau 1 des matériaux supplémentaires. Pour le mécanisme par étapes, l’atome H5 sera d’abord transféré à l’atome O3 du groupe carbonyle, tendant à générer une nouvelle liaison entre N4 et l’atome C2 via l’état de transition stw-ts1. Ensuite, un intermédiaire thiolester (intmed) sera formé. Par conséquent, la seconde migration de H5 aura lieu du groupe hydroxyle à l’atome S1 via stw-ts2 ainsi que la rupture de la liaison S1-C2, ce qui dirigera finalement vers les produits.
Les voies concertées et par étapes de la réaction catalysée par les arylamines N-acétyltransférases.
(a)
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(d)
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La structure des états de transition pour la voie concertée et la voie par étapes du PABA.
Les résultats indiquent que tous les états de transition sont caractérisés par une structure cyclique à quatre chaînons qui est presque planaire. Il y a deux petits angles inférieurs à 80° dans chaque état de transition (C2S1H5 et S1C2N4 pour les con-ts, C2O3H5 et C2N4H5 pour les stp-ts1, C2S1H5 et S1C2O3 pour les stp-ts2), qui apportent une grande contrainte au système entier et le rendent instable. Parmi les six états de transition concertés (con-ts) de tous les substrats, les propriétés de la liaison C2N4, N4H5 et S1H5 sont à peu près les mêmes pour tous les substrats, tandis que l’interaction entre S1 et C2 est un des facteurs déterminants pour l’étape concertée.
Les choses deviennent différentes pour les cheminements par étapes. Les changements d’hybridation de l’atome C2 suivent une tendance similaire (𝑠𝑝3→𝑠𝑝2→𝑠𝑝3) pour tous les substrats au cours de l’acétylation par étapes (tableau 1 supplémentaire). La première migration de H5 va conduire à l’état de transition stp-ts1, puis un intermédiaire nommé intmed est localisé sur la surface d’énergie potentielle (PES), qui est un minimum local. Il s’agit d’un intermédiaire thiolester tétraédrique comme proposé dans les études expérimentales précédentes. Il a une courte durée de vie et un transfert conséquent de H5 se produira bientôt via l’état de transition stp-ts2. Pour la voie par étapes, les structures des états de traction pour différents substrats diffèrent très peu des autres. Les structures 3D des états de transition ont été répertoriées pour le PABA (figure 2), les autres sont similaires à celles.
3.3. Les énergies
Les énergies relatives de toutes les voies possibles pour les six substrats sont effectuées sur la base de la somme d’énergie des réactifs prise comme zéro (figure 3). D’après la figure 3, nous constatons que les voies concertées sont favorisées par rapport aux voies par étapes. Les barrières énergétiques des états de transition concertés (con-ts) sont inférieures à celles des états de transition par étapes (stp-ts1) dans une plage de 83,5 kJ/mol à 26,9 kJ/mol (tableau 2 supplémentaire). Les arylhydrazines sont de meilleurs substrats que les arylamines, et la HDZ est la plus réactive avec l’énergie d’activation la plus basse, ce qui correspond aux données expérimentales avec un bon accord. Cette conclusion peut également être tirée de l’analyse des données de structure (tableau 1 supplémentaire). L’effet de conjonction renforcé et la délocalisation des paires solitaires d’azote au niveau du squelette ont stabilisé l’état de transition. La bioactivité pour tous les substrats est augmentée dans une séquence de PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ.
Les profils énergétiques pour tous les substrats.
4. Conclusions
Les conclusions suivantes peuvent être tirées .
(i)Tous les substrats peuvent être acétylés par deux voies différentes : la voie concertée et la voie par étapes, et la première est de loin préférée en raison des énergies d’activation plus faibles.(ii)D’après nos calculs, les arylhydrazines sont de meilleurs substrats que les arylamines, et la HDZ est la plus réactive avec l’énergie d’activation la plus faible. La bioactivité pour tous les substrats est augmentée dans une séquence comme PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ, ce qui correspond très bien aux résultats expérimentaux . (iii)L’effet de conjonction et les paires solitaires délocalisées jouent des rôles très importants dans l’acétylation. Le renforcement de l’effet de conjonction et l’augmentation du nombre de paires solitaires au niveau du cycle à six chaînons conduiront à la barrière d’énergie plus faible.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la Fondation scientifique naturelle nationale de Chine (no.20603030, no.20873074, et no.10674114.), le projet 973 du ministère de la Science et de la Technologie de Chine (no.2009CB930103), la Fondation scientifique naturelle de la province de Shandong (no.Q2008B07), et la Fondation pour les groupes de recherche créative de l’Université de Ludong (no.08-CXA001).
Matériaux supplémentaires
Pour la limitation de longueur de cet article, les structures 3D de toutes les arylamines, et les substrats d’arylhydrazines, les données de structure principale pour tous les états de transition et les énergies relatives pour les différentes voies ont été rassemblées dans les matériaux supplémentaires.
- Matériaux supplémentaires
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