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Di G.P. ThomasApr 15 2013

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La cromatografia liquida ad alte prestazioni o cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) è un metodo cromatografico che viene utilizzato per separare una miscela di composti in chimica analitica e biochimica in modo da identificare, quantificare o purificare i singoli componenti della miscela. Fornisce una ritenzione dinamica dei composti che possiedono funzionalità idrofobiche e organiche. Una combinazione di interazioni idrofobiche e di tipo van der Waals tra tutti i composti target e le fasi stazionarie e mobili permette la ritenzione di questi composti tramite la fase inversa.

Come funziona l’HPLC?

In quantità molto piccole, la miscela del campione da separare e analizzare viene inviata in un flusso di fase mobile che percolano attraverso una colonna. Ci sono diversi tipi di colonne disponibili con sorbenti di varie dimensioni delle particelle e superfici.

La miscela si muove attraverso la colonna a velocità variabili e interagisce con il sorbente, noto anche come fase stazionaria. La velocità di ogni componente della miscela dipende 1) dalla sua natura chimica, 2) dalla natura della colonna e 3) dalla composizione della fase mobile. Il tempo in cui uno specifico analita emerge dalla colonna è definito come tempo di ritenzione. Il tempo di ritenzione viene misurato in condizioni specifiche e considerato come la caratteristica identificativa di un determinato analita.

Le particelle assorbenti possono essere di natura idrofoba o polare. Le fasi mobili comunemente usate includono qualsiasi combinazione miscibile di acqua e solventi organici come l’acetonitrile e il metanolo. Possono essere utilizzate anche fasi mobili senza acqua.

La componente acquosa della fase mobile potrebbe contenere acidi come l’acido formico, fosforico o trifluoroacetico o sali per permettere la separazione dei componenti del campione. La composizione della fase mobile viene mantenuta costante o variata durante l’analisi cromatografica. L’approccio costante è efficace per la separazione dei componenti del campione che non sono molto dissimili nella loro affinità per la fase stazionaria. Nell’approccio variato, la composizione della fase mobile varia da bassa ad alta forza di eluizione. La forza di eluizione della fase mobile si riflette sui tempi di ritenzione degli analiti, dove un’alta forza di eluizione produce un’eluizione veloce.

La composizione della fase mobile viene scelta in base all’intensità delle interazioni tra diversi componenti del campione e la fase stazionaria.

Il processo di partizionamento HPLC è molto simile al processo di estrazione liquido-liquido, tranne che il primo è un processo continuo, a differenza del secondo che è un processo a fasi. Si raccomanda di eseguire processi di partizionamento di prova per determinare il metodo HPLC esatto che fornirebbe una separazione adeguata.

Produttori di sistemi HPLC

C’è una vasta gamma di opzioni HPLC sul mercato oggi. La seguente è una lista di vari produttori di sistemi HPLC con una breve introduzione dei loro prodotti:

• Dionex, una società basata sulla scienza della cromatografia, produce il sistema LC UltiMate® 3000 Rapid Separation, il sistema UltiMate 3000 RSLCnano, e la famiglia Corona® di rivelatori universali di aerosol carichi.
• Jasco Analytical Instruments fornisce una gamma di sistemi HPLC. I sistemi HPLC della serie LC-2000 Plus sono configurabili in modo unico. Con alte prestazioni e basso costo, questi sistemi HPLC possono essere adattati praticamente a qualsiasi esigenza, dal semplice QA isocratico allo sviluppo avanzato di metodi multi-solvente/multi-colonna. La LC-2000plus-Iso isocratica è dotata di una pompa, un degasatore, un autocampionatore e un rilevatore UV/Vis. La pompa è progettata con velocità di flusso da 1µL a 10mL/min a pressioni fino a 500 bar per l’uso con colonne da 2, 3, 4, 6 e fino a 10mm ID. Il Gradiente Binario LC-2000plus-HPG è simile al sistema isocratico ma è dotato di una configurazione di pompa a gradiente a due solventi. Le portate della pompa sono compatibili con colonne da 1 mm. Il Gradiente Quaternario LC-2000plus-LPG è anche simile al sistema isocratico; tuttavia, questo modello è dotato di una configurazione di pompa a gradiente quaternario per la massima flessibilità del solvente.
• Il Sistema HPLC Preparativo di Gilson ha un’ampia gamma di flusso che può essere adattata sia per separazioni semi-preparative che preparative. La sua elevata potenza di pompaggio permette un’ampia gamma di dimensioni delle colonne preparative. Il sistema è progettato con un nuovo sistema di stazione di risciacquo che comprende un lavaggio a getto fluente e consente l’uso di fino a due diversi solventi di risciacquo.
• I sistemi HPLC Sharp™ di AAPPTec sono dotati di pompe controllate da microprocessore, consentendo così portate altamente precise e accurate, che possono aiutare a ottenere un’eccellente riproducibilità analitica e la massima accuratezza di misurazione.

Altri produttori nel mercato attuale sono Agilent, Beckman Coulter, Bio-Rad e Buck Scientific.

Benefici dell’HPLC

I vantaggi principali dei sistemi HPLC sono i seguenti:

• Controlla e automatizza la strumentazione per la cromatografia
• Fornisce la gestione dei dati, le funzioni di sicurezza, i rapporti e la validazione degli strumenti.
• Potente e adattabile
• Aumenta la produttività gestendo tutte le aree di analisi – dal campione allo strumento, e dalla separazione alla segnalazione dei risultati.
• Affrontabile

Applicazioni dell’HPLC

Lo scopo principale della tecnica HPLC è di identificare, quantificare e purificare un particolare analita o composto. Si possono fare sia analisi quantitative che qualitative. Gli HPLC possono essere utilizzati nelle seguenti applicazioni:

• Purificazione dell’acqua
• Rilevamento di impurità nelle industrie farmaceutiche
• Preconcentrazione di componenti in tracce
• Cromatografia a scambio di ligandi
• Cromatografia a scambio ionico di proteine
• Cromatografia a scambio anionico ad alta pressione di carboidrati
• Cromatografia a scambio ionicodi carboidrati e oligosaccaridi

Fonti e ulteriori letture

• Cromatografia in fase inversa HPLC/UHPLCPhenomenex
• Prodotti Dionex-Dionex
• Sistemi HPPLC-aapptec
• Sistema HPLC Preparativo-Gilson

Questo articolo è stato aggiornato il 22 aprile, 2019.

Scritto da

G.P. Thomas

Gary si è laureato all’Università di Manchester con una laurea con lode in geochimica e un master in scienze della terra. Dopo aver lavorato nell’industria mineraria australiana, Gary ha deciso di appendere gli stivali da geologo e dedicarsi alla scrittura. Quando non sta sviluppando contenuti attuali e informativi, Gary può solitamente essere trovato a suonare la sua amata chitarra, o a guardare l’Aston Villa FC strappare la sconfitta dalle fauci della vittoria.

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