Abstract
V tomto článku jsou pomocí teorie funkcionálu hustoty zkoumány mechanismy acetylace několika vybraných typických substrátů z experimentů, včetně arylaminů a arylhydrazinů. Výsledky ukazují, že všechny přechodné stavy jsou charakterizovány strukturou čtyřčlenného kruhu a hydralazin (HDZ) je nejsilnějším substrátem. Bioaktivita všech sloučenin se zvyšuje v posloupnosti PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ. Klíčovou roli v reakci hraje konjunkční efekt a delokalizace osamělých párů N atomu. Všechny výsledky jsou v souladu s experimentálními údaji.
1. Úvod
Arylamin N-acetyltransferasy (NAT, EC 2.3.1.5) jsou enzymy II. fáze metabolismu, které se vyskytují u prokaryot i eukaryot . Reakce N-acetylace vede k detoxikaci arylaminových xenobiotik a nakonec směřuje k elektrofilním arylnitrenovým iontům, které jsou považovány za zodpovědné za tvorbu aduktů DNA . Dva funkční izozymy NAT, NAT1 a NAT2, vykazují velké rozdíly v substrátové specifitě a tkáňové distribuci navzdory 81% aminokyselinové sekvenční identitě . Druhý z nich, NAT2, je exprimován převážně v játrech a střevním epitelu . Předchozí studie předpokládaly, že NAT katalyzují přenos acetylu klasickým ping-pongovým kinetickým mechanismem (schéma 1). Analýza místně řízené mutageneze lidské NAT2 a Salmonella typhimurium NAT (StNAT) naznačila, že za zprostředkování procesu acetylace je zodpovědný cysteinový zbytek v aktivním místě. Nedávné presteady-state a steady-state kinetické studie p-nitrofenylacetátu (PNPA) a NAT2 odhalily, že katalytický mechanismus NAT2 může záviset na tvorbě páru thiolát-imidazol. Ačkoli se enzym vyskytuje jak u eukaryot, tak u prokaryot, endogenní role NAT je stále nejasná . Stanovení substrátů odhalilo, že NATs mohou acetylovávat jak arylaminy, tak arylhydraziny . Potřebné kroky v reakci přenosu acetylu se skládají z přenosu acetylové skupiny ze zbytku cysteinu v aktivním místě na substrát a z odstranění jednoho protonu z tohoto zbytku na substrát. V této práci je k dispozici podrobná teoretická studie o chování substrátů arylaminů a arylhydrazinů při acetylaci, včetně vlastností jejich struktur, přechodových stavů, profilů energií.
Reakce přenosu acetylu katalyzovaná NATs.
2. Metodiky
Všechny výpočty byly provedeny metodou teorie funkcionálu hustoty (DFT) B3LYP implementovanou v programovém balíku Gaussian03 , která byla již dříve úspěšně použita na řadě enzymatických systémů. Při použití základních sad 6-31G* a 6-311+G (3df, 2p) byla dána přednost hybridnímu funkcionálu B3LYP před metodami Hartree-Fock (HF) a MP2 . Přestože někdy selhává při zpracování interakcí bohatých na disperzi, byla metoda B3LYP úspěšně použita na mnoha biologických systémech .
Geometrie všech reaktantů, meziproduktů a produktů jsou optimalizovány na úrovni teorie B3LYP/6-31G* . Byly zjištěny nejstabilnější konformace i jejich energie při každé rovnováze a přechodových stavech. Pro všechny výsledné stacionární body jsou provedeny frekvenční výpočty a každý přechodový stav má pouze jednu imaginární frekvenci. Dále je na optimalizovaných strukturách stacionárních bodů použita metoda MP2/6-311+G** pro získání přesnějších energetických profilů. Pokud to není zvlášť zdůrazněno, všechny následující energetické analýzy se vztahují k výsledkům z výpočtů MP2/6-311+G**//B3LYP/6-31G (d).
3. Výsledky a diskuse
3.1. Výsledky a diskuse Hranice substrátů
Šest substrátů, kyselina p-aminobenzoová(PABA), 4-methoxylanilin(4-MA), 4-aminosalicylát (4-AS), 5-aminosalicylát(5-AS), isoniazid(INZ), hydralazin (HDZ), bylo vybráno podle referencí , které lze rozdělit do dvou odlišných rodin: arylaminy a arylhydraziny. V tabulce 1 jsou uvedeny energie pro hraniční obitaly (včetně HOMO-2, HOMO-1, HOMO, LUMO, LUMO+1 a LUMO+2) všech šesti substrátů, které jsou považovány za hrající důležitou roli v bioenzymatických systémech . U arylaminů se energie HOMO snižují v pořadí 4-MA > 5-AS > PABA > 4-AS, což naznačuje zvyšování jejich nukleofilní reaktivity. Ze všech šesti substrátů (viz obr. 1 v doplňkových materiálech dostupných online na doi: 10.1155/2009/783035) má INZ největší energetickou mezeru mezi HOMO a LUMO, což naznačuje jeho stabilitu. Výsledky analýzy přirozené populace (NPA) ukázaly, že aktivní N atomy aminokyselin pro skupinu arylaminů jsou elektronegativnější než atomy skupiny hydrazinů, což je způsobeno především konjugačním efektem.
Přestože PABA a 4-AS mají různé substituce na p- místě aminoskupiny u šestičlenného kruhu, jejich bioaktivita je téměř stejná. Mezimolekulární H-vazba stabilizuje samotný substrát s poklesem energie asi o 19-21 kJ/mol. Energie HOMO i LOMO pro 5-AS jsou vyšší než pro 4-A𝑆s, což naznačuje, že první z nich je reaktivnější než druhý.
U substrátů arylhydrazinů bude osamělý pár atomů N na páteři šestičlenného kruhu delokalizován na celý systém, takže se zvýší jeho stabilita. Hodnoty 𝐸(𝐿-𝐻) HDZ jsou o 0,0318 a.u. vyšší než u INZ, což svědčí o jeho vyšší reaktivitě než u INZ.
3.2. Reaktivita HDZ je vyšší než u INZ. Různé cesty a přechodové stavy
V zásadě mohou všechny substráty reagovat se zbytkem cysteinu v aktivním místě sladěnou nebo postupnou cestou. K prvnímu z nich dochází v přechodových stavech (viz obr. 1 a 2, kon-ty) ke koordinovanému přenosu vodíku H5 na atom S1 cysteinu a vzniku vazby mezi atomy N4 a C2. K přerušení starých vazeb (N4H5 a S1C2) a vzniku nových (C2N4 a S1H5) dochází současně. Reaktanty a cílové produkty jsou spojeny jediným přechodným stavem na povrchu potenciální energie (PES). Hlavní strukturní údaje všech přechodových stavů jsou uvedeny v tabulce 1 doplňkových materiálů. Pro postupný mechanismus se atom H5 nejprve přenese na atom O3 karbonylové skupiny, což směřuje ke vzniku nové vazby mezi N4 a atomem C2 prostřednictvím přechodového stavu stw-ts1. Poté se vytvoří thiolesterový meziprodukt (intmed). Následně dojde k druhé migraci H5 z hydroxylové skupiny na atom S1 prostřednictvím stw-ts2 spolu s přerušením vazby S1-C2, což nakonec povede k produktům.
Souhlasné a postupné cesty pro reakci katalyzovanou arylaminovými N-acetyltransferázami.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Struktura přechodových stavů pro sladěnou i postupnou cestu PABA.
Výsledky ukazují, že všechny přechodné stavy jsou charakterizovány strukturou čtyřčlenného kruhu, která je téměř rovinná. V každém přechodovém stavu jsou dva malé úhly menší než 80° (C2S1H5 a S1C2N4 pro kon-ts, C2O3H5 a C2N4H5 pro stp-ts1, C2S1H5 a S1C2O3 pro stp-ts2), které vnášejí do celého systému velké napětí a činí jej nestabilním. Mezi šesti sladěnými přechodovými stavy (kon-ts) všech substrátů jsou vlastnosti vazeb C2N4, N4H5 a S1H5 pro všechny substráty zhruba stejné, zatímco interakce mezi S1 a C2 je jedním z určujících faktorů pro sladěný krok.
U stupňovitých drah je situace odlišná. Hybridizační změny atomu C2 mají podobnou tendenci (𝑠𝑝3→𝑠𝑝2→𝑠𝑝3) pro všechny substráty během krokové acetylace (doplňková tabulka 1). První migrace H5 povede k přechodovému stavu stp-ts1 a poté se na povrchu potenciální energie (PES) nachází meziprodukt s názvem intmed, který představuje lokální minimum. Jedná se o tetraedrický thiolesterový meziprodukt, jak bylo navrženo v předchozích experimentálních studiích . Je krátkodobý a brzy dojde k následnému přenosu H5 přes přechodový stav stp-ts2. Pro stupňovitou dráhu se struktury přechodových stavů pro různé substráty velmi málo liší od ostatních. 3D struktury přechodových stavů byly uvedeny pro PABA (obr. 2), ostatní byly podobné.
3.3. Struktura přechodových stavů pro PABA (obr. 2). Energie
Relativní energie všech možných cest pro šest substrátů jsou provedeny na základě součtu energií reaktantů, které jsou brány jako nulové (obrázek 3). Z obrázku 3 zjistíme, že sladěné dráhy jsou upřednostňovány před dráhami krokovými. Energetické bariéry sladěných přechodových stavů (con-ts) jsou nižší než bariéry krokových (stp-ts1) v rozmezí 83,5 kJ/mol až 26,9 kJ/mol (doplňková tabulka 2). Arylhydraziny jsou lepšími substráty než arylaminy a HDZ je nejreaktivnější s nejnižší aktivační energií, což odpovídá experimentálním údajům s dobrou shodou . Tento závěr lze vyvodit i z analýzy strukturních dat (doplňková tabulka 1). Zesílený konjunkční efekt a delokalizace dusíkových osamělých párů na páteři stabilizovaly přechodový stav. Bioaktivita pro všechny substráty se zvyšuje v sekvenci PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ.
Energetické profily pro všechny substráty.
4. Závěry
Lze učinit následující závěry.
(i)Všechny substráty lze acetylovat dvěma různými cestami: dohodnutou a postupnou, přičemž první z nich je mnohem výhodnější díky nižším aktivačním energiím.(ii)Z našeho výpočtu vyplývá, že arylhydraziny jsou lepšími substráty než arylaminy a HDZ je nejreaktivnější s nejnižší aktivační energií. Bioaktivita pro všechny substráty se zvyšuje v pořadí jako PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ, což velmi dobře odpovídá experimentálním výsledkům . (iii) Konjunkční efekt a delokalizované osamělé páry hrají při acetylaci velmi důležitou roli. Zesílený konjunkční efekt a zvyšující se počet osamělých párů na šestičlenném kruhu povede ke snížení energetické bariéry.
Poděkování
Tato práce byla podpořena National Natural Scientific Foundation of China (č. 20603030, č. 20873074 a č. 10674114).), projektu 973 Ministerstva vědy a techniky Číny (č. 2009CB930103), Přírodní vědecké nadace provincie Šan-tung (č. Q2008B07) a Nadace pro tvůrčí výzkumné skupiny Univerzity Ludong (č. 08-CXA001).
Doplňkové materiály
Pro omezení délky tohoto článku byly v doplňkových materiálech shromážděny 3D struktury všech arylaminů a substrátů arylhydrazinů, hlavní strukturní údaje pro všechny přechodové stavy a relativní energie pro různé cesty.
- Doplňkové materiály
.