Free Press

By G.P. ThomasApr 15 2013

Image Credits: khawfangenvi16/.com

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie neboli vysokotlaká kapalinová chromatografie (HPLC) je chromatografická metoda, která se používá k separaci směsi sloučenin v analytické chemii a biochemii tak, aby bylo možné identifikovat, kvantifikovat nebo přečistit jednotlivé složky směsi.

HPLC s obrácenou fází neboli ultra-vysokoúčinná kapalinová chromatografie (UHPLC) je běžně používaný způsob separace. Zajišťuje dynamickou retenci sloučenin, které mají hydrofobní a organické funkce. Kombinace hydrofobních interakcí a interakcí van der Waalsova typu mezi všemi cílovými sloučeninami a stacionární i mobilní fází umožňuje retenci těchto sloučenin pomocí obrácené fáze.

Jak funguje HPLC?

Ve velmi malém množství se směs vzorků, která má být separována a testována, pošle do proudu mobilní fáze prosakující kolonou. K dispozici jsou různé typy kolon se sorbenty různých velikostí částic a povrchů.

Směs se pohybuje kolonou různou rychlostí a interaguje se sorbentem, známým také jako stacionární fáze. Rychlost každé složky ve směsi závisí na 1) její chemické povaze, 2) povaze kolony a 3) složení mobilní fáze. Doba, za kterou se určitý analyt vynoří z kolony, se označuje jako jeho retenční čas. Retenční čas se měří za specifických podmínek a považuje se za identifikační charakteristiku daného analytu.

Sorbční částice mohou být hydrofobní nebo polární povahy. Mezi běžně používané mobilní fáze patří jakákoli mísitelná kombinace vody a organických rozpouštědel, jako je acetonitril a metanol. Lze také použít mobilní fáze bez vody.

Vodná složka mobilní fáze může obsahovat kyseliny, jako je kyselina mravenčí, fosforečná nebo trifluoroctová, nebo soli, které umožňují separaci složek vzorku. Složení mobilní fáze se buď udržuje jako konstantní, nebo se během chromatografické analýzy mění. Konstantní přístup je účinný pro separaci složek vzorku, které se příliš neliší svou afinitou ke stacionární fázi. Při proměnlivém přístupu se složení mobilní fáze liší od nízké po vysokou eluční sílu. Eluční síla mobilní fáze se odráží v retenčních časech analytů, kde vysoká eluční síla způsobuje rychlou eluci.

Složení mobilní fáze se volí na základě intenzity interakcí mezi několika složkami vzorku a stacionární fází.

Postup dělení HPLC je dosti podobný postupu extrakce kapalina-kapalina s tím rozdílem, že první je kontinuální proces, na rozdíl od druhého, který je postupný. Doporučuje se provést zkušební rozdělovací procesy, aby se určila přesná metoda HPLC, která by zajistila odpovídající separaci.

Výrobci systémů HPLC

V současné době je na trhu široká škála možností HPLC. Následuje seznam různých výrobců systémů HPLC se stručným představením jejich produktů:

• Společnost Dionex, která si zakládá na vědě o chromatografii, vyrábí systém UltiMate® 3000 Rapid Separation LC, systém UltiMate 3000 RSLCnano a rodinu univerzálních detektorů nabitých aerosolů Corona®.
• Jasco Analytical Instruments poskytuje řadu systémů HPLC. Systémy HPLC řady LC-2000 Plus jsou jedinečně konfigurovatelné. Díky vysokému výkonu a nízkým nákladům lze tyto systémy HPLC přizpůsobit prakticky jakémukoli požadavku od jednoduché izokratické kontroly kvality až po pokročilý vývoj metod s více roztoky/více kolonami. Isokratický systém LC-2000plus-Iso je vybaven čerpadlem, odplyňovačem, autosamplerem a UV/Vis detektorem. Čerpadlo je navrženo s průtoky od 1 µl do 10 ml/min při tlaku až 500 barů pro použití s kolonami o průměru 2, 3, 4, 6 a až 10 mm. Binární gradientový systém LC-2000plus-HPG je podobný izokratickému systému, ale je vybaven konfigurací gradientového čerpadla se dvěma rozpouštědly. Průtoky čerpadla jsou kompatibilní s 1mm kolonami. Quaternary Gradient LC-2000plus-LPG je rovněž podobný izokratickému systému, avšak tento model je vybaven konfigurací kvartérního gradientního čerpadla pro maximální flexibilitu rozpouštědel.
• Preparativní HPLC systém od společnosti Gilson má široký rozsah průtoku, který lze přizpůsobit pro semipreparativní i preparativní separace. Jeho vysoký čerpací výkon umožňuje širokou škálu velikostí preparativních kolon. Systém je navržen s novým systémem proplachovací stanice, který se skládá z průtočného tryskového proplachu a umožňuje použití až dvou různých proplachovacích rozpouštědel.
• Systémy Sharp™ HPLC od společnosti AAPPTec jsou vybaveny čerpadly, která jsou řízena mikroprocesorem, a umožňují tak velmi přesné a vysoce precizní průtoky, což může pomoci dosáhnout vynikající analytické reprodukovatelnosti a nejvyšší přesnosti měření.

Dalšími výrobci na současném trhu jsou Agilent, Beckman Coulter, Bio-Rad a Buck Scientific.

Výhody HPLC

Klíčové výhody systémů HPLC jsou následující:

• Řídí a automatizuje chromatografické přístroje
• Zajišťuje správu dat, bezpečnostní funkce a podávání zpráv a validaci přístroje.
• Výkonný a přizpůsobivý
• Zvyšuje produktivitu řízením všech oblastí analýzy – od vzorku po přístroj a od separace po hlášení výsledků.
• Dostupný

Použití HPLC

Hlavním účelem techniky HPLC je identifikace, kvantifikace a purifikace určitého analytu nebo sloučeniny. Lze provádět jak kvantitativní, tak kvalitativní analýzu. HPLC lze použít v následujících aplikacích:

• Čištění vody
• Detekce nečistot ve farmaceutickém průmyslu
• Prekoncentrace stopových složek
• Ligand-výměnná chromatografie
• Iontově-výměnná chromatografie bílkovin
• Vysokofrekvenční aniontová chromatografie
• Vysoká pHvýměnná chromatografie sacharidů a oligosacharidů

Zdroje a další literatura

• Chromatografie na obrácené fázi HPLC/UHPLC-Phenomenex
• Dionex Products-Dionex
• HPLC Systems-aapptec
• Preparative HPLC System-Gilson

Tento článek byl aktualizován 22. dubna, 2019.

Napsal

G.P. Thomas

Gary vystudoval geochemii na univerzitě v Manchesteru s vyznamenáním první třídy a magisterský obor vědy o Zemi. Po práci v australském důlním průmyslu se Gary rozhodl pověsit geologické boty na hřebík a věnovat se psaní. Když zrovna nevytváří aktuální a informativní obsah, Garyho obvykle najdete, jak hraje na svou milovanou kytaru nebo sleduje, jak fotbalový klub Aston Villa FC vyrval porážku ze spárů vítězství.

Citace

.