3.1.2 Azider
Azid anses for at være en af de mest velegnede grupper til bioorthogonale reaktioner og klik-kemi. I modsætning til keton og aldehyd er der næsten ingen azider, der forekommer i biologiske systemer. Azider har en høj intrinsisk energi, men ingen naturlig reaktionspartner (King og Wagner, 2014), har små størrelser og en neutral samlet ladning, og endelig er de kinetisk stabile under fysiologiske forhold.
Staudinger-ligeringen (Staudinger og Hauser, 1921) synes at være en god kandidat til biokonjugationsreaktioner ved hjælp af azider. I denne reaktion reagerer azider med triphenylphosphinreagenser, der indeholder en elektrofil fælde, for at producere et aza-ylidintermediat, der reagerer med den elektrofile estercarbonylgruppe og danner en femleddet ring, der undergår hydrolyse for at generere en endelig stabil amidbinding (fig. 5.6A) (Steen Redeker et al., 2013; Staudinger og Hauser, 1921). En ny variant af denne reaktion blev beskrevet kort tid efter (King og Wagner, 2014; Saxon og Bertozzi, 2000; Saxon et al., 2000; Saxon et al., 2000; Nilsson et al., 2000), benævnt “traceless Staudinger-ligering”, hvor det endelige amid-bundne produkt frigøres fra fosfinoxiddelen.
Figur 5.6. Eksempler på biokonjugationsreaktioner med azider. (A) Staudinger-ligering; (B) kobberkatalyseret azid-alkyne cycloaddition; (C) stammepromoveret azid-alkyne cycloaddition; (D) cycloaddition med oxanorbornadiener. UAA, unaturlige aminosyrer.
Staudinger-ligeringen er blevet anvendt i en række forskellige applikationer. For eksempel anvendte Raines et al. denne reaktion som cysteinfrit alternativ til NCL til peptidligering (Nilsson et al., 2001) og i kombination med NCL i samlingen af kunstig RNAase A (Nilsson et al., 2005). Desuden blev den anvendt i andre anvendelser, såsom proteinimmobilisering på fast underlag til in vitro og in vivo billeddannelse (Saxon og Bertozzi, 2000; Prescher et al., 2004), mærkning af biomolekyler in vitro og in vivo (Saxon og Bertozzi, 2000; Prescher et al, 2004; Vocadlo et al., 2003), proteinberigelse (Vocadlo et al., 2003) og detektion (Charron et al., 2009) samt (Lemieux et al., 2003) proteinmodifikation.
Nu har Staudinger-ligeringen dog nogle ulemper. Nemlig dens langsomme kinetik (anden ordens hastighedskonstant i det lave 10-3 M-1s-1 område) (Lin et al, 2005), fosfinforbindelsernes oxidationslabilitet (behov for at anvende relativt høje koncentrationer af fosfinreagenset) og fosfinernes potentielle krydsreaktivitet med disulfider (Lang og Chin, 2014; King og Wagner, 2014).
Azider kan reagere med alkyner i en Cu(I)-katalyseret azid-alkyne cycloaddition (CuAAC) eller 1,3-dipolar cycloaddition (Fig. 5.6B), et af de mest standardiserede eksempler på klik-kemireaktioner (Rostovtsev et al, 2002; Tornøe et al., 2002). Denne reaktion er af stor interesse inden for biologisk videnskab på grund af dens gode selektivitet, høje udbytte og milde reaktionsbetingelser (stuetemperatur i forskellige opløsningsmidler). Desuden kan både azider og alkyner indføres i proteiner uden at påvirke proteinets struktur og funktion (Steen Redeker et al., 2013). Azidet og alkynet kan meget hurtigt danne en stabil 1,2,3-triazolbinding under fysiologiske forhold i nærvær af Cu(I). Den mekanisme, der er foreslået af Sharpless et al. (Rostovtsev et al., 2002), beskriver først indførelsen af det terminale alkyn i et kobberacetylid og et efterfølgende angreb af azidet (King og Wagner, 2014). For nylig er denne mekanisme blevet yderligere forfinet, og der er blevet foreslået et dicobberintermediat (Worrell et al., 2013). De største ulemper ved denne reaktion er de Cu(I)-afhængige bivirkninger og Cu(I)-cytotoksiciteten (Baskin et al., 2007; Plass et al., 2011), hvilket har begrænset dens anvendelse primært til mærkning i det ekstracellulære rum (King og Wagner, 2014). CuAAC er blevet anvendt i vid udstrækning i mange forskellige biologiske undersøgelser, f.eks. til mærkning af fosfolipider med henblik på deres billeddannelse in vivo (Jao et al., 2009) og in vitro (Neef og Schultz, 2009), til virusoverfladeomdannelse (Steinmetz et al, 2009), til at modificere/mærke proteiner in vitro og in vivo (Link og Tirrell, 2003; Ngo og Tirrell, 2011; Liu og Schultz, 2010; Deiters et al., 2003), til at mærke nukleinsyrer (Weisbrod og Marx, 2008) og affinitetsbaseret sondeprofilering (Speers et al., 2003).
Der er udviklet forskellige metoder til at overvinde kobbercytotoksiciteten. Nemlig brugen af vandopløselige ligander til Cu(I)-koordinering, brugen af kobber-chelaterende organiske azider og indførelsen af ringspænding i alkyneenheden. I det første tilfælde koordinerer de vandopløselige ligander Cu(I) for at danne en aktiveret kobberkatalysator, der er i stand til at fremme CuAAC ved lave mikromolære koncentrationer af metal og samtidig reducere Cu(I)’s potentielle toksicitet (Besanceney-Webler et al., 2011; Del Amo og Wang, 2010; Hong et al., 2009; Kennedy et al., 2011). I det andet tilfælde øges den effektive Cu(I)-koncentration på reaktionsstedet ved at anvende azidligander, der indeholder en intern kobberchelaterende del (Brotherton et al., 2009; Kuang et al., 2010; Uttamapinant et al., 2012). Den sidste strategi omfatter brugen af alkyner, som er blevet aktiveret til at reagere med forbedret kinetik i fravær af katalysator. I denne henseende øger brugen af cyclooctyneenheder reaktiviteten som følge af ringspændingsfrigørelsen (Steen Redeker et al., 2013; Baskin et al., 2007; Plass et al., 2011). Den stammepromoverede azid-alkyne cycloaddition (SPAAC) (Fig. 5.6C) er blevet et kraftfuldt værktøj ikke kun til protein- og antistofmærkning, men også til andre anvendelser såsom antistoffri Western Blot-analyse (Boutureira et al., 2015), fordi der ikke er behov for yderligere reagenser eller giftige metaller, der kan skade biomolekyler. Bertozzi et al. har f.eks. bevist, at den kan anvendes til modifikation af rensede proteiner (Baskin et al., 2007). I yderligere eksperimenter blev reaktionen med succes anvendt in vitro på fibroblastceller (Baskin et al., 2007). Endvidere blev SPAAC anvendt til at afbilde tumorer i levende mus ved hjælp af nanopartikler (Koo et al., 2012) og 18F PET, hvor fluor blev bundet til både azid og cycloalkyne (Jeon et al., 2012). Andre anvendelsesområder blev fundet inden for virusmodifikation og DNA-mærkning (Qiu et al., 2013). Imidlertid kan den komplekse syntese af cyclooctynes og de kendsgerninger, at deres øgede bulkiness og hydrofobicitet kan påvirke proteinstrukturen og stabiliteten (Kim et al, 2013), og at deres øgede aktivering kan fremme sidereaktioner med naturligt forekommende thioler kan betragtes som ulemper.
Elektronmangelfulde sulfonylazider kan også reagere med aktiverede alkener (oxanorbornadiener eller norbornener) i en metalfri cycloaddition (Fig. 5.6D), svarende til SPAAC (Alder, 1930; Huisgen et al., 1980). Produktet af azid-alkene cycloadditioner er imidlertid en relativt ustabil triazolin i modsætning til de aromatiske triazoler, der dannes i den klassiske klikcycloaddition. Et oxanorbornadien, der både er spændt og elektronfattigt, blev anvendt som dipolarofil i en reaktion med azider (van Berkel et al., 2008). I dette tilfælde reagerer den belastede dobbeltbinding i oxanorbornadien med azider for at danne en intermediær triazolin, der spontant gennemgår en retro Diels-Alder-reaktion med frigivelse af furan, hvilket fører til stabile 1,2,3- eller 1,4,5-triazoler. Denne reaktion blev anvendt til selektivt at biokonjugere et oxanorbornadien-funktionaliseret protein og et azidmodificeret cyklisk peptid i vandige buffere. Selv om oxanorbornadiener er lettere at syntetisere end deres cyclooctyne-modstykker, er denne cycloadditionsreaktion ret langsom og ikke helt kemoselektiv med hensyn til andre funktionelle grupper, der findes i proteiner, hvilket kan have begrænset dens udbredte anvendelse (Lang og Chin, 2014; van Berkel et al., 2008).