Free Press

Indledning

For at kunne levere tilstrækkelige fødevarer og ernæring til den globale befolkning, der forventes at nå op på 9 milliarder i 2050 (http://www.unpopulation.org), er det nødvendigt at øge risudbyttet med mindst 60 % (FAO 2009). Ris er basisfødevare for over halvdelen af verdens befolkning, og denne risforbrugende befolkning vokser med 1,098 % om året (http://esa.un.org/wpp/Excel-Data/population.htm). Den voksende befolkning betyder større efterspørgsel efter fødevarer, vand og jord på et tidspunkt, hvor naturressourcegrundlaget for landbruget forringes, fordi store landbrugsarealer omlægges fra fødevareproduktion til industrialisering og produktion af biobrændsel. Uforudsigelige klimaændringer truer med yderligere at reducere landbrugsarealerne som følge af flere tilfælde af tørke og oversvømmelser (http://www.fao.org/docrep/017/aq191e/aq191e.pdf). Da en voksende befolkning og globale klimaændringer lægger et stigende pres på verdens fødevareforsyning, er det vigtigt, at vi fortsat forbedrer afgrødernes produktivitet med hensyn til kornproduktion for at holde trit med befolkningstilvæksten. Den øgede afgrødeproduktivitet, som de plantetyper, der blev skabt under den grønne revolution, gav mulighed for at støtte befolkningsboomet efter de to verdenskrige. Siden da er udbyttepotentialet for de nuværende risdyrkningssorter til trods for anvendelsen af forbedrede sorter og avancerede teknologier kun blevet forbedret en smule, hvilket tyder på, at disse sorter har nået et udbytteloft (Akita 1994). Der er for nylig gjort forsøg på at øge risens udbyttepotentiale ved at udvikle en effektiv fotosyntese af C4-typen i ris (Kajala et al. 2011). Til dette formål skal et sæt gener, der regulerer bladets anatomi og biokemiske processer, indsættes i ris og udtrykkes på en hensigtsmæssig måde, hvilket i øjeblikket ikke er muligt udelukkende ved hjælp af konventionelle planteforædlingsteknikker. Derfor vil genteknologi til forbedring af ris’ fotosynteseveje give tilstrækkelige muligheder for at øge den faktiske kornproduktivitet og udbyttepotentialet. Gensplejsning er et effektivt og præcist forædlingsværktøj, hvor kun de relevante gener kan indføres, selv fra fjernt beslægtede arter.

I C3-planter som ris assimileres CO2 til en 3-kulstofforbindelse af det fotosyntetiske enzym ribulose-1,5-bisfosfatcarboxylase oxygenase (Rubisco). Som navnet antyder, katalyserer Rubisco også oxidation af ribulose-1, 5-bisfosfat (RuBP) i en spildproces kendt som fotorespiration, der kan medføre et tab på op til 25 % af det tidligere fastlagte kulstof (Sage 2004). Ved temperaturer over 30 °C, som er typiske for tropiske risproducerende områder i verden, stiger iltningshastigheden betydeligt, og dette reducerer C3-plantens fotosyntetiske effektivitet betydeligt med op til 40 % (Ehleringer og Monson 1993). Derfor bliver fotosyntesen af ris i troperne og de varme tempererede områder ineffektiv. C4-planter, som har en CO2-koncentreringsmekanisme i deres blade, har meget reducerede niveauer af fotorespiration og har således udviklet sig til at trives i varme, tørre miljøer og giver værdifuld indsigt i strategier til forbedring af afgrøder. Ris med en C4-fotosyntesemekanisme ville have øget fotosyntesens effektivitet og samtidig udnytte knappe ressourcer som jord, vand og gødning, især kvælstof, mere effektivt (Hibberd et al. 2008). Da C4-ris vil fungere godt ved høje temperaturer og kræve mindre vand og kvælstof, vil C4-ris være til gavn for forskellige typer risøkosystemer, herunder marginale områder.

C4-fotosyntese er en af de tre typer biokemiske mekanismer, som planter anvender til at binde atmosfærisk CO2, mens de andre er C3- og Crassulacean acid metabolism (CAM) pathways. C4-fotosyntesen har udviklet sig mere end 66 gange uafhængigt af hinanden (Sage et al. 2012) i mindst 19 familier i løbet af angiospermernes udvikling fra C3-forfædre (Muhaidat et al. 2007), og den medfører ændringer i de cellulære strukturer, biokemien og dermed udviklingen af bladene. Denne højt specialiserede form for fotosyntese har i det væsentlige udviklet en CO2-koncentreringsmekanisme omkring Rubisco-enzymet, hvorved Rubiscos oxygenasefunktion elimineres, hvorved spild af energi som følge af fotorespiration reduceres (Douce og Heldt 2000). Rubisco fra C4-arter er mere effektiv end fra C3-arter med hensyn til carboxylering (Kubien et al. 2008). De andre fordele, der er forbundet med C4-systemet, omfatter højere vandudnyttelsesgrad, fordi en stejlere koncentrationsgradient for CO2-diffusion kan opretholdes gennem delvist lukkede stomata, højere strålingsudnyttelsesgrad, da C4-fotosyntesens effektivitet ikke bliver mættet ved høj lysintensitet (Rizal et al. 2012) og højere kvælstofudnyttelsesgrad, fordi den vil kræve mindre Rubisco og dermed mindre kvælstof.

C4-planter er potentielt mere produktive ved højere temperaturer, som ris typisk udsættes for. For at drage fordel af dette mere effektive fotosyntesesystem på et tidspunkt, hvor befolkningstallet og fødevarepriserne stiger kraftigt, er der bestræbelser på at indsætte C4-mekanismen, som den, der findes i majs, i ris (Rizal et al. 2012). Denne nye tilgang til at ændre fotosyntesesystemet i ris er en udfordrende og langsigtet opgave, fordi C4-vejen er meget kompleks, og mange af de faktorer, der styrer mekanismen, er stadig ukendte. Derfor kræver det opfindsomhed og ekspertise fra forskere, der er involveret i forskellige discipliner som f.eks. genteknologi, biokemi, bioinformatik, molekylærbiologi, fotosyntese, systembiologi, fysiologi, planteforædling, metabolomik osv. Af samme grund blev C4-ris-konsortiet konceptualiseret og etableret, som begyndte det praktiske arbejde med C4-ris-teknik siden 2009 (http://photosynthome.irri.org/C4rice/). Denne gennemgang giver en opdatering af kravene til udvikling af C4-ris og de fremskridt, der er gjort inden for genteknologi. På baggrund af undersøgelsen af udviklingen af C4 fra C3-arter og de dermed forbundne ændringer er følgende ændringer afgørende for at etablere en funktionel C4-fotosyntetisk vej i ris.

Forøgelse af antallet og størrelsen af kloroplaster i bundle sheath cells i ris

I ris er mere end 90 % af de samlede kloroplaster placeret i mesofylceller (MC’er) i bladet (Yoshimura et al. 2004); mens både MC’er og bundle sheath cells (BSC’er) i C4-planter besidder lige mange kloroplaster (figur 1A og B). Dette skyldes, at i C3-planter foregår hele fotosynteseprocessen i MC, men i C4-planter er fotosynteseprocessen opdelt i MC og BSC. MC’erne udfører den første CO2-fiksering, hvor der dannes en 4-kulstofforbindelse kaldet oxaloacetat, som omdannes til C4-syrer såsom malat, der transporteres ind i BSC’erne og derved muliggør en effektiv assimilering af CO2 til kulhydrater gennem Calvin-cyklusen i BSC’erne. I modsætning til C3-planter har C4-planternes BSC’er derfor fotosyntetiske funktioner som f.eks. decarboxylering af C4-forbindelsen og Calvin-cyklusprocessen. For at kunne udføre disse processer er BSC’erne i C4-planter forstørret og har flere kloroplaster, hvilket gør BSC’erne mere udprægede og fotosyntetisk aktive. BSC’erne i C3-arter har til opgave at afbalancere det hydrauliske tryk, forhindre luftindtrængning fra intercellulære rum til xylem, danne et vandreservoir som buffer for tab som følge af transpiration, tillade indgang og spredning af lys med højere intensitet, der rammer årerne, ind i bladet (Nikolopoulos et al. 2002). Yderligere funktioner af BSC’er i C3-planter omfatter transport af kvælstof, svovl, kulhydrat og rolle i signalvejene, som er blevet grundigt gennemgået i (Leegood 2008). I C4-arter samarbejder BSC’er og MC’er i en totrinsversion af fotosyntesen. For at sikre en direkte kontakt mellem BSC’er og MC’er har C4-planter derfor en særlig form for bladanatomi, der ledsages af spredning af kloroplaster i BSC’er. Hvis C4-vejen skal indføres i ris, er det nødvendigt med flere fotosyntetiske kloroplaster i BSC’erne, end ris har nu. Dette kan gøres ved at overudtrykke de genetiske elementer, der er nødvendige for kloroplastudviklingen, såsom Golden2-lignende (GLK) gener på en cellespecifik måde ved at anvende C4-genpromotorer såsom phosphoenolpyruvatcarboxylase (PEPC) fra Zea mays til MC-specifik ekspression og phosphoenolpyruvatcarboxykinase (PCK) promotor fra Zoysia japonica til BSC-specifik ekspression i risblade (Matsuoka et al. 1994; Nomura et al. 2005).

Golden2-like (GLK) genfamiliens medlemmer koder for nukleare transkriptionsfaktorer, der er blevet impliceret i reguleringen af kloroplastudviklingen i Arabidopsis, Zea mays og mosset Physcomitrella patens (Rossini et al. 2001). I hver af disse arter findes GLK-generne som et homologe par, der kaldes GLK1 og GLK2 (Waters et al. 2009). I mos og Arabidopsis er GLK-generne redundante og funktionelt ækvivalente, mens GLK-generne i majs og sorghum fungerer på en celletypespecifik måde for at styre udviklingen af dimorfe kloroplaster (Waters et al. 2008; Wang et al. 2013a). I majs akkumuleres Golden2 (G2) og dets homolog ZmGLK1 transkript primært i henholdsvis BS- og M-celler, hvilket tyder på en specifik rolle for hvert gen, der regulerer den dimorfe kloroplastdifferentiering (Wang et al. 2013a).

Reducerer veneafstanden og øger derved venetætheden i bladet

I C3-arter finder fotosyntesen sted i MC’erne. Et stort antal MC’er mellem de på hinanden følgende årer (figur 1A) skubber årerne langt væk fra hinanden og øger dermed årerafstanden eller reducerer åretætheden. I risblade er der mindre end 6 årer pr. mm (figur 2A), mens Setaria viridis og sorghum (begge er typiske C4-arter) har mere end 7 årer pr. mm (figur 2B og C). C4-blade har i gennemsnit 2 MC’er mellem årerne (figur 1B). Den højere venetæthed i C4-planternes blade fører til et næsten en-til-en-forhold mellem M- og BS-vævenes volumen. Den indre anatomi af et C4-blad er ofte sammensat af et gentagende mønster af vene-BS-M-M-M-BS-åre. BSC’er omgivet af MC’er danner en kranslignende struktur; denne type bladanatomi blev betegnet som “Kranz-anatomi” af den tyske botaniker G. Haberlandt. C4 BSC’er har tæt cytoplasma og er fyldt med et stort antal kloroplaster (figur 1B). For at C4-cyklusen kan fungere effektivt, er det nødvendigt med en tæt kontakt mellem M- og BS-cellerne, og disse er tæt forbundet med hinanden med et stort antal plasmodesmata Dengler og (Nelson 1999). Kranz-anatomien findes med ringe variation i næsten alle monokotyledoners og dikotyledoners slægter, der anvender den tocellede C4-fotosyntesebane med to celler. Undersøgelser af bladets anatomi og morfologi har afsløret adskillige gener, der er ansvarlige for vækst, udvikling eller deformiteter af celler i bladene. Et gen ACAULIS1 var ansvarlig for forlængelse af bladcellerne (Tsukaya et al. 1993). Mutation i genet CURLEY LEAF (CLF) gav krøllede blade i Arabidopsis (Kim et al. 1998). Forøgelse af frie veneafslutninger, åbent venemønster og afrundet bladstruktur blev forårsaget af rotunda 1 (RON1) (Robles et al. 2010). Mutation i Scarecrow-genet i majs viste en stigning i antallet af BSC’er, usædvanlig differentiering af BS-kloroplast, fald i mindre årer og ændring i åretætheden (Slewinski et al. 2012). Disse undersøgelser vedrørende den unormale veneudformning forårsaget af mutation af bestemte gener giver et fingerpeg om, hvordan Kranz-anatomien reguleres, og tyder på, at flere veje er involveret i udviklingen af Kranz-mønsteret. Det er blevet fastslået, at SCARECROW/SHORTROOT-reguleringsnetværket er en af de vigtige komponenter, der er nødvendige for Kranz-anatomimønsteret, fordi bladene hos C3-planter med muteret Scarecrow-gen var normale, mens der i C4-planter var mutation i det samme gen, der beskadigede Kranz-anatomien (Slewinski et al. 2012; Wang et al. 2013b). For nylig er det blevet vist, at introduktion af majskromosomer i havre kunne øge BSC-størrelsen og reducere veneafstanden i C3-havreblade, hvilket viser, at C3-bladets anatomi kan ændres (Tolley et al. 2012). Desuden er der gjort en stor indsats for at screene sorghum (C4) mutanter med øget venafstand og ris (C3) mutanter med reduceret venafstand, således at de gener, der kontrollerer egenskaben venafstand, kan identificeres (Rizal et al. 2012).

Aktiviteten af Calvin-cyklusen skulle være betydeligt reduceret i MC og stærkt forøget i BSC hos ris

C4-fotosyntese er karakteriseret ved en biokemisk CO2-pumpemekanisme, der hæver koncentrationen af CO2 på Rubisco-stedet. Et højt CO2-niveau omkring Rubisco reducerer fotorespirationshastigheden og øger netto CO2-assimilationen, hvilket fører til en meget effektiv fotosyntese Weber og von (Caemmerer 2010). For at opnå dette er CO2-assimilationen i C4 fordelt på to celletyper, MC’erne og BSC’erne (figur 3). Derfor afhænger C4’s kulstoffiksering af cellespecifik genekspression og lokalisering. De nærliggende fotosyntetisk aktive BS- og M-celler interagerer for at eliminere Rubisco-katalyseret O2-fiksering. I tocellede C4-planter af tocelletypen fikseres CO2 først til C4-syre kaldet oxaloacetat i MC’er af en O2-usensitiv carboxylase kaldet phosphoenolpyruvatcarboxylase (PEPC, EC 4.1.1.31). Oxaloacetat omdannes derefter til malat eller aspartat og transporteres til BSC’er, hvor det dekarboxyleres, og CO2 frigives. Denne CO2 genfikseres af Rubisco, og alle de efterfølgende aktiviteter i Calvin-cyklusen finder sted i chloroplasten i BSC’erne (Nelson og Langdale 1989). For at få C4-ris til at fungere skal Rubisco-aktiviteten derfor reduceres kraftigt i MC’erne og øges i BSC’erne, hvilket begrænser Calvincyklussen til BSC’erne i ris, som i et C4-system. På den anden side skal visse gener, der koder for C4-enzymer som f.eks. β-kulsyreanhydrase (CA) og PEPC overudtrykkes i cytosolen i MC’er af ris for at lette den primære CO2-fiksering, så CO2 kan koncentreres og tilføres Rubisco i BSC’erne. C4-cyklusen indebærer også en omfattende transport af metabolitter gennem chloroplasthindehindehinden og plasmalemmaet i MC og BSC (figur 3). Ud over de centrale C4-enzymer CA, PEPC, pyruvat orthofosfat (Pi)dikinase (PPDK, EC 2.7.9.1), NADP-afhængig malatdehydrogenase (NADP-MDH, EC 1.1.1.1.82) og NADP-afhængigt æblesyreenzym (NADP-ME, EC 1.1.1.1.82) er der også andre C4-enzymer, som er afhængige af NADP, EC 1.1.1.1.82 og NADP-ME, EC 1.1.1.82.40), C4-vejen kræver også indsættelse af metabolittransportører for oxaloacetat, malat, triosephosphat og pyruvat i ris for at give øget transportkapacitet for C4-cyklusintermediaterne, således at Calvin-cyklusen kan fungere effektivt i BSC’erne (Weber og von Caemmerer 2010).

Fotorespirationen i mesofylcellerne skal reduceres kraftigt

I C3-planter foregår kulstoffiksering og Calvin-cyklus i MC’erne. Under kulstoffiksering reagerer ribulose-1,5-bisfosfat (RuBP) – en femkulstofforbindelse, der katalyseres af et enzym ribulose-1,5-bisfosfatcarboxylaseoxygenase (Rubisco, EC.4.1.1.1.39) med CO2 for at danne to molekyler af en 3-kulstofforbindelse kaldet 3-fosfoglycerat (3-PGA). I Calvin-cyklussen danner de to PGA-molekyler et energirigt sukkermolekyle (triosephosphat) og regenererer RuBP til den næste cyklus. Ved de nuværende CO2-koncentrationer i atmosfæren (ca. 400 ppm) katalyserer Rubisco også en reaktion mellem RuBP og O2, hvilket resulterer i et molekyle af hver af 2-fosfoglycolat og 3-PGA (Peterhansel og Maurino 2011). 2-fosfoglycolatet skal omdannes tilbage til 3-PGA gennem den proces, der kaldes fotorespiration, som omfatter en række biokemiske reaktioner. Under denne proces sker der et tab af tidligere fikseret kulstof og kvælstof, og der skal også bruges ekstra energi (Sharpe og Offermann 2013).

C4 planter har udviklet mekanismer til at begrænse lokalisering og aktiviteter af Rubisco i BSC’er. MC’er forhindrer rumligt kontakten mellem Rubisco i BSC’er og O2 i de intercellulære rum, hvilket forhindrer tab af energi gennem fotorespiration. C4-planternes eliminering af fotorespiration fremgår af deres meget lave CO2-kompensationspunkt, som er næsten nul, og deres konstant høje carboxyleringseffektivitet (CE) uden at reagere på ændringer i O2-koncentrationerne (figur 4). I modsætning hertil faldt kompensationspunktet hos C3-planter med ændringen i O2-koncentrationen fra 21 % til 2 % betydeligt fra 55 til 30 ppm (tabel 1). I figur 4 blev CE beregnet i henhold til (Li et al. 2009), som viste, at CE i sorghum ikke ændrede sig signifikant med ændringen i O2-niveauet, men i ris var der en meget signifikant forbedring af CE, da O2-niveauet blev sænket fra 21 til 2 % (figur 4 og tabel 1). Stigningen i CE i sorghum var kun 6,1 %, mens den i ris var 41,5 % ved et fald i den intercellulære O2-koncentration til 2 % (tabel 1). Disse data viser, at der er et stort potentiale for at øge den fotosyntetiske kapacitet i ris ved at mindske fotorespirationen, hvilket igen vil øge udbyttet betydeligt. En måde at reducere fotorespirationen i MC er ved at reducere glycin-decarboxylaseproteinet (GDC) i MC og begrænse dets ophobning i BSC, således at decarboxyleringen af glycin udelukkende finder sted i BSC, hvorved der genereres en højere CO2-koncentration i BSC, svarende til den i C3-C4-mellemprodukter (Monson og Rawsthorne 2000). C4-ris-konsortiet afprøver denne fremgangsmåde ved at anvende kunstigt microRNA designet mod risens GDC-H-underenhed, som drives af ZmPEPC-promotor (Kajala et al. 2011). En sådan biokemisk mekanisme kræver cellulær specialisering af BSC’erne, som omfatter en forøgelse af antallet af kloroplaster og mitokondrier, der beriger organelindholdet i ris-BSC’erne for at hjælpe med at genindfange den CO2, der frigives ved GDC’s dekarboxylering af glycin (Ueno 2011). En anden tilgang, der var vellykket til at indfange den CO2, der frigives ved fotorespiration til fotosyntesen, er ved at overføre Escherichia coli-glycolat-katabolikvejen til kloroplaster af Arabidopsis thaliana, hvor glycolat i kloroplasten blev direkte omdannet til glycerat (Kebeish et al. 2007). Denne strategi, som reducerede fotorespirationen og forbedrede fotosyntesen i Arabidopsis, involverede trinvis nuklear transformation med fem kloroplastmålrettede bakteriegener, der koder for glycolatdehydrogenase, glyoxylatcarboligase og tartronisk semialdehydreduktase, kunne anvendes på andre C3-planter som f.eks. ris, men brugen af bakteriegener er måske ikke at foretrække ved konstruktionen af C4-ris.

Engineering af C4-vej i ris

Det blev antaget, at enkeltcellede C4-systemer kunne være hurtigere at installere i C3-planter. Der er også gjort forsøg på at konstruere et enkeltcellet C4-fotosyntesesystem i ris (Miyao et al. 2011). For at indføre enkeltcellet C4-lignende vej, hvor MC er lavet til at indfange og frigive CO2 på samme måde, som det sker i Hydrilla verticillata (L.f) Royle, blev fire enzymer (PEPC, PPDK, NADP-MDH og NADP-ME), der er involveret i vejen, overproduceret i de transgene risblade (Ku et al. 1999; Fukayama et al. 2001; Tsuchida et al. 2001; Taniguchi et al. 2008). Nogle af de største problemer, der er opstået, og som skal løses for at skabe en encellet C4-lignende vej i ris, er: mekanisme til at lette transporten af PEP gennem kloroplasthindevæggen, import af OAA til kloroplasterne og retningen af NADP-ME-reaktionen, inddragelse af NADP-MDH, tilstedeværelsen af endogent PEPC i risens MC-kloroplast og yderligere forøgelse af NADP-MDH-aktiviteten blev rapporteret som værende nødvendig (Miyao et al. 2011). Terrestriske encellede C4-arter som Bienertia cycloptera, B. sinuspersici og Suaeda aralocaspica, der tilhører Chenopodiaceae-familien, har også brug for rumlig kompartmentalisering af kulstofassimilation og decarboxylering (Chuong et al. 2006). Disse arter har dimorfe kloroplaster i disse rum. De tidligere forsøg gav en forgæves cyklus, hvilket skyldtes, at der ikke skete nogen ændring i anatomien, at der ikke fandtes egnede transportører, og at de majsgener, der blev transformeret til ris, ikke blev udtrykt på passende måde på en cellespecifik måde og ikke blev reguleret som i majs, men reguleret som de endogene C3-isoformer i ris (Miyao et al. 2011).

For at konstruere den fotosyntetiske vej fra C3 til C4 inden for to årtier, hvilket tog millioner af år i naturen, begyndte C4-ris-konsortiet den samtidige genopdagelse og konstruktion af allerede kendte gener i ris med henblik på at danne C4-ris med en anatomi af Kranz-typen. C4-gener som CA, PEPC, PPDK, NADP-ME og NADP-MDH er klonet fra majs og transformeret til ris. Også de transportører, der blev overudtrykt i C4-metaboliske veje, såsom 2-oxoglutarat/malat-transporter (OMT1), dicarboxylat-transporter1 (DiT1), dicarboxylat-transporter2 (DiT2), PEP/fosfat-transporter (PPT1), mesofyl-hindeprotein (MEP) og triose-fosfat-fosfat-translocator (TPT), der for nylig blev identificeret gennem proteomik af BS- og MS-celler fra majs (Friso et al. 2010) er blevet transformeret til ris (figur 3). Medlemmerne af C4-konsortiet for ris er også involveret i opdagelsen af nye gener relateret til Kranz-anatomi (Wang et al. 2013b). Når de lovende kandidatgener, der kontrollerer Kranz-anatomien, er blevet testet, vil de også blive introduceret i de risplanter, der er blevet manipuleret med C4-biokemiske vejgener.