Free Press

Abstract

Objekt. Mens værdien af Ki-67 er blevet anerkendt i brystkræft, er der også kontroverser. Målet med denne undersøgelse er at vise den prognostiske værdi af Ki-67 i henhold til progesteronreceptor (PgR)-udtryk hos patienter, der har østrogenreceptor- (ER-) positiv, human epidermal vækstfaktorreceptor 2- (HER2-) negativ tidlig brystkræft. Metoder. Journalerne for ikke-metastatiske invasive brystkræftpatienter, der blev opereret på en enkelt institution mellem 2009 og 2012, blev gennemgået. Det primære endepunkt var recidivfri overlevelse (RFS), og det sekundære endepunkt var den samlede overlevelse (OS). Ki-67 og PgR blev vurderet med immunohistokemi for tumoren efter operationen. Resultater. I alt 1848 patienter blev indskrevet i denne undersøgelse. 223 (12 %) patienter havde høj (≥10 %) Ki-67-ekspression, og 1625 (88 %) havde lav Ki-67-ekspression. Signifikant dårligere RFS og OS blev kun observeret i høj vs. lavt Ki-67-ekspression, når PgR var lav (<20%) ( og 0,005, henholdsvis for RFS og OS). Der var ingen signifikant forskel i RFS og OS i henhold til Ki-67, når PgR var høj ( og 0,076). RFS for fire grupper i henhold til højt/lavt Ki-67- og PgR-ekspression blev sammenlignet. Gruppen med lavt PgR- og højt Ki-67-ekspression viste det dårligste resultat blandt dem (). I en multivariat analyse var høj Ki-67 en uafhængig prognostisk faktor, når PgR var lav (HR 3,05; 95 % CI 1,50-6,19; ). Konklusioner. Ki-67 havde kun en værdi som prognostisk faktor under et lavt PgR-ekspressionsniveau i tidlig brystkræft. PgR bør tages i betragtning ved vurdering af prognosen for brystkræftpatienter ved hjælp af Ki-67.

1. Indledning

Prognosen for brystkræftpatienter er meget varierende og afhænger af flere karakteristika. Brystkræft udgør en heterogen gruppe af tumorer med histopatologiske, immunohistokemiske (IHC) og genetiske forskelle . Klinisk-histopatologiske karakteristika er længe blevet anvendt til at vurdere prognosen og træffe beslutning om behandlingsplaner. Der er siden blevet udviklet surrogatmetoder, der anvender almindeligt tilgængelige IHC-tests for østrogenreceptor (ER), progesteronreceptor (PgR), human epidermal vækstfaktorreceptor 2 (HER2) og Ki-67 . For nylig er genomiske oplysninger blevet integreret i klinikken med henblik på at forudsige prognosen for brystkræft og træffe beslutning om systemisk behandling . På grund af høje omkostninger og tekniske problemer er genetiske tests imidlertid ikke altid tilgængelige i store dele af verden. Biomarkørernes rolle er stadig vigtig for at afgøre, om patienten vil have gavn af en bestemt behandling.

Inkrementeret proliferation er et kendetegn for maligne tumorer og er en væsentlig parameter for forudsigelse af terapirespons . Ki-67 er et repræsentativt proliferationsindeks. Mange undersøgelser har anvendt Ki-67 som en præsumptiv uafhængig prædiktiv markør for behandling med prognostisk værdi for det kliniske resultat samt sygdomsfri og samlet overlevelse . Der er imidlertid også en kontrovers om brugen af Ki-67, idet nogle undersøgelser tyder på, at Ki-67 mangler prognostisk værdi .

Saint Gallen-konsensus anerkendte en skelnen mellem “luminal A-lignende” og “luminal B-lignende” tumor og støttede værdien af Ki-67 for den robuste prognostiske information, som den giver . Udviklingen af multigene-analyser har muliggjort mere raffinerede definitioner af brystkræftsubtyper. Patienter med IHC-baserede luminal A-tumorer i den lave PgR-gruppe havde en betydeligt dårligere sygdomsfri overlevelse end patienterne i den høje PgR-gruppe . En tidligere undersøgelse rapporterede, at 51,3 % af IHC-luminal A-tumorer med PgR-ekspression ≤20 % faldt ind under den intrinsiske luminal B-klassifikation, og at kun 30,9 % af IHC-luminal B-tumorer med PgR-ekspression >20 % faktisk var intrinsiske luminal B-tumorer . Således er den PgR-baserede IHC-klassifikation af luminale subtyper, der anvendes klinisk, noget unøjagtig, og en kombination af denne klassifikation med Ki-67-ekspression kan forbedre den diagnostiske nøjagtighed.

Målet med denne undersøgelse var at klarlægge den uafhængige prognostiske værdi af bestemmelse af Ki-67-ekspression. Til dette formål undersøgte vi forholdet mellem Ki-67- og PgR-ekspressionsniveauer i klinisk praksis og korrelerede ekspressionen af disse markører med klinikopatologiske variabler.

2. Materialer og metoder

2.1. Undersøgelsespopulation

Dokumentationen for 1848 patienter med patologisk bekræftet invasiv brystkræft, der blev opereret på kirurgisk afdeling, Seoul National University Hospital (SNUH; Seoul, Sydkorea), mellem juli 2009 og december 2012 blev retrospektivt indsamlet. Patienter med ER-positiv og HER2-negativ brystkræft blev inkluderet, uafhængigt af PgR-status. Patienter, der blev diagnosticeret med in situ-karcinom eller fjernmetastaser ved den første diagnose, eller som tidligere var blevet opereret for brystkræft, blev udelukket, ligesom de patienter, for hvilke data om PgR eller Ki-67 ikke var tilgængelige. Vi udelukkede ikke patienter, der gennemgik neoadjuverende systemisk behandling. IHC-analyse blev udført fra vævet ved hjælp af kernebiopsi i en diagnose. Hvis oplysningerne fra de oprindelige væv var utilstrækkelige, brugte vi permanente sektioner hos de patienter, der ikke fik neoadjuverende systemisk behandling. Biopsivæv blev udtaget fra patienter, der gennemgik neoadjuverende systemisk behandling forud for behandlingen. Undersøgelsespopulationen omfattede patienter med en diagnose af stadium I til IIIC i henhold til AJCC’s (American Joint Committee on Cancer, 8. udgave) patologiske stadieinddelingssystem. Recidiv blev opdelt i lokoregionalt og fjerntliggende. Kontralaterale recidiv blev ikke medtaget blandt recidivkategorierne i denne undersøgelse. Det primære endepunkt var recidivfri overlevelse (RFS) i forhold til Ki-67- og PgR-ekspressionsstatus. Opfølgningsperioden svarede til intervallet fra operationen til den sidste dato for et hospitalsbesøg, uanset hvilken afdeling der blev besøgt. Det sekundære endepunkt var den samlede overlevelse (OS). I forbindelse med opfølgninger blev patienternes elektroniske patientjournaler gennemgået frem til november 2015; dødsfald blev registreret på grundlag af rapporter fra december 2013. RFS blev klassificeret i fire grupper baseret på korrelationer med Ki-67- og PgR-ekspression.

2,2. IHC-procedure

ER-, PgR-, HER2- og Ki-67-ekspression blev bestemt ved IHC i formalinfikserede, paraffinindlejrede vævsblokke. Ekspressionsniveauet for hormonreceptorer, HER2 og Ki-67 blev vurderet ved hjælp af avidin-biotin-kompleksteknikken . Vævene blev skåret i 4 μm tykke sektioner, deparaffiniseret med xylen, rehydreret med en gradueret ethanolserie og nedsænket i Tris-buffered saline. Repræsentative sektioner blev immunfarvet, og mere end 10 højstyrkefelter blev tilfældigt udvalgt og undersøgt under et optisk mikroskop. Efter antigenretrieval blev sektionerne inkuberet med primære antistoffer mod ER (1DO5; Dako, Danmark; 1 : 50), PgR (PgR636; Dako; 1 : 50), HER2 (CB11; Novocastra Laboratories, upon-Tyne, UK; 1 : 200) og Ki-67 (MIB-1; Dako; 1 : 800) i de angivne fortyndinger. Sektionerne blev derefter inkuberet med biotinyleret sekundært anti-mus antistof og farvet med streptavidin peberrodsperoxidase (Zymed Laboratories, San Francisco, CA, USA). Sektionerne blev kontrafarvet med Mayers hæmatoxylin, dehydreret, renset og derefter monteret med henblik på undersøgelse. IHC-prøverne blev analyseret af en erfaren patolog på SNUH. Den grænseværdi, der blev anvendt til at definere lavt versus højt Ki-67-ekspression, var tilstedeværelsen af Ki-67-immunreaktivitet i mere end 10 % af de farvede kerner i tumorvæv. Grænseværdien på 10 % for Ki-67 viste sig at have den bedste forudsigelsesværdi for prognosen på SNUH . Patienterne blev inddelt i tumorer med lavt (<20 %) og højt (≥20 %) PgR-ekspression. PgR-cutoff på 20 % er baseret på den internationale brystkræftkonference 2013 Saint Gallen International Breast Cancer Conference .

2,3. Statistisk analyse

Patienterne blev inddelt i grupper med lav og høj Ki-67-ekspression og grupper med lav og høj PgR-ekspression. Klinisk-patologiske karakteristika blev vurderet ved hjælp af alle parvise sammenligninger af grupper. Kategoriske variabler blev sammenlignet ved hjælp af chi-square eller Fisher’s exact test. Student’s t-test blev anvendt til sammenligning af kontinuerte variabler mellem to grupper. RFS blev defineret som intervallet fra operationsdatoen til datoen for den første observation af et recidiv eller den sidste opfølgningsdato uden tegn på recidiv. OS blev defineret som intervallet fra operationsdatoen til dødsdatoen eller datoen for sidste opfølgning. Overlevelsesraten blev anslået ved hjælp af Kaplan-Meier-metoden, og forskelle mellem to grupper blev sammenlignet ved hjælp af log-rank-testen. I univariate og multivariate analyser af overlevelsesrater blev der anvendt Cox proportional hazard-regression med justering for forskellige faktorer. Cox-regressionsanalyser blev anvendt til at beregne hazard ratio’er (HR) og 95 % konfidensintervaller (CIs). Værdierne var tosidede, og statistisk signifikans blev defineret som en værdi <0,05. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS-software, version 21 til Windows (IBM Corp., Chicago, IL, USA).

3. Resultater

3.1. Klinisk-patologiske karakteristika for patienterne

I alt 1.848 patienter blev indskrevet i denne undersøgelse. Klinikopatologiske karakteristika for analyserede patienter blev tilgået ved at sammenligne undergrupper med lavt og højt PgR-ekspression og undergrupper med lavt og højt Ki-67-ekspression og undergrupper med lavt og højt Ki-67-ekspression. Gennemsnitsalderen var 49-52 år i hver undergruppe. Større kræftformer (>2 cm) var hyppigere forbundet med høj Ki-67 () og lav PgR (). Histologisk grad (HG) dikotomiserede prøverne i lave og høje undergrupper, hvor grad 3 klassificeres som høj, og grad 1 + 2 klassificeres som lav. Node-positive og high-HG-prøver blev også identificeret i undergrupper med høj Ki-67- og lav PgR-værdi. Det er signifikant, at flere tilfælde med lav PgR gennemgik neoadjuverende kemoterapi, uanset Ki-67-status. Desuden gennemgik flere patienter med høj Ki-67 adjuverende kemoterapi, uanset PgR-status. Vi overvejede også tumorkarakteristika i henhold til operationsmetoden. I alt 719 patienter gennemgik mastektomi, og et større antal af disse patienter havde et lavt PgR-ekspression end et højt PgR-ekspression. Der var imidlertid ingen signifikant sammenhæng mellem Ki-67-undergrupper og hyppigheden af mastektomi. Kun PgR-undergrupper var signifikant forskellige blandt axilakirurgiske typer. Recidiv, hvad enten det var lokalt eller fjernt, blev observeret hos 52 patienter. Recidiv var lokalt i 10 tilfælde og fjernt i 42 tilfælde. Resultaterne vedrørende dødelighed er baseret på offentlige data fra Indenrigsministeriet; i 2013 (sidste år, for hvilket der blev undersøgt dødelighedsdata) var 11 patienter døde (tabel 1).

RFS var signifikant bedre for patienterne i gruppen med lavt Ki-67-ekspression end for patienterne i gruppen med højt Ki-67-ekspression (; Figur 1(a)). RFS var også signifikant bedre for gruppen med højt PgR-ekspression end for gruppen med lavt PgR-ekspression (; Figur 1(b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Interessant nok viste en undergruppeanalyse, at RFS baseret på Ki-67-ekspressionsstatus var signifikant forskellig i den lave PgR-undergruppe, men ikke i den høje PgR-undergruppe. Specifikt var RFS for patienter med højt Ki-67-ekspression og lavt PgR-ekspression (<20 %) dårligere end i gruppen med lavt Ki-67-ekspression og lavt PgR-ekspression (; Figur 2(a)). Blandt patienter i gruppen med højt PgR-ekspression (≥20 %) var der derimod ingen signifikant forskel mellem grupper med højt og lavt Ki-67-ekspression (; Figur 2(b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

RFS blev yderligere analyseret ved at korrelere den med undergrupper opdelt i fire grupper baseret på Ki-67- og PgR-ekspression. Patienter med lavt PgR- og højt Ki-67-ekspression viste det dårligste resultat sammenlignet med de tre andre grupper (; Figur 3).

Figur 3

Den recidivfri overlevelse af patienter blev opdelt i 4 gruppe kombination mellem Ki-67- og progesteronreceptorekspression.

Multivariate Cox-regressionsmodeller viste, at Ki-67 ikke var signifikant forbundet med høj PgR-ekspressionsstatus, efter justering for faktorer, herunder Ki-67-ekspressionsgruppe, alder, tumorstørrelse, nodal status og HG (HR 2,03; 95 % CI 0,61-6,72; ; Tabel 2). For patienter i undergruppen med lav PgR-ekspression var Ki-67 markant forbundet med RFS (HR 3,05; 95% CI 1,50-6,19; ; Tabel 2). Tumorstørrelse var statistisk signifikant med RFS i begge PgR-status.

Lav PgR-status Høj PgR-status HR (95% CI) HR (95% CI) Alder 1.00 (0.97-1.03) 0.856 0.99 (0.95-1.04) 0.713 Tumorstørrelse ≥2 cm, <2 cm 7,20 (2,53-20,51) <0.001 5.40 (1.49-19.60) 0.010 Nodal status Ja, nej 1.66 (0.79-3.45) 0.179 2.53 (0.94-6.77) 0.065 Ki-67 ≥10%, <10% 3,05 (1,50-6,19) 0,002 2,03 (0,61-6,19) 0,002 2,03 (0,61-6.72) 0,247 HG Højt, lavt 1,78 (0,85-3,72) 0,127 0,82 (0,28-2,40) 0,82 (0,28-2,40) 0.719

Tabel 2

Multivariat Cox-regressionsanalyse for recidivfri overlevelse.

Analyse af det sekundære endepunkt, OS, viste ligeledes en overlegen overlevelse i undergruppen med lav Ki-67 med lavt PgR-ekspression (; Figur 4(a)) og ingen signifikant forskel i OS mellem Ki-67-undergrupper i gruppen med højt PgR (; Figur 4(b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 4

Gennemsnitlig overlevelse (OS) for patienter i høj og lav Ki-67 brystkræft i henhold til progesteronreceptorekspressionsstatus. (a) OS i henhold til Ki-67 i undergruppen med lavt progesteronreceptorudtryk (PgR < 20%). (b) RFS i henhold til Ki-67 i undergruppen med høj progesteronreceptorekspressionsstatus (PgR ≥ 20 %).

Den gennemsnitlige sygdomsfri overlevelsestid var 70 måneder i undergruppen med lav PgR/høj Ki-67 og 75 måneder i undergruppen med høj PgR/lav Ki-67. Den gennemsnitlige samlede overlevelsestid var henholdsvis 74 måneder og 76 måneder for undergruppen med lav PgR/høj Ki-67 og høj PgR/lav Ki-67.

4. Diskussion

Her evaluerede vi værdien af Ki-67 som en uafhængig prognostisk faktor for recidiv og overlevelse hos ikke-metastatiske brystkræftpatienter med ER-positive og HER2-negative tumorer. I overensstemmelse med tidligere rapporter viste vores undersøgelse, at Ki-67-ekspression udviste en betydelig prognostisk værdi, men vi påviste endvidere, at Ki-67 ikke altid er en uafhængig prognostisk faktor. Specifikt havde Ki-67 kun værdi som en prognostisk faktor i gruppen med lavt PgR-ekspression. I vores undersøgelse viste en sammenligning af RFS mellem de fire ekspressionsundergrupper den dårligste prognose i undergruppen med lavt PgR-niveau og højt Ki-67-niveau. Og denne undergruppe var 120 ud af 1848 patienter. Derfor kan aktiv behandling overvejes hos ca. 6 % af patienterne. Med hensyn til forudsigelse af prognosen tyder vores resultater på, at kombinationen af Ki-67-ekspressionsniveauet med PgR-ekspressionsniveauet forbedrer den prædiktive værdi. Allison et al. rapporterede en stærk korrelation mellem høje Oncotype DX Recurrence Scores med grad 3 og lavt til ikke-eksisterende PR-ekspression og Ki-67 > 10% . Thakur et al. viste desuden, at høj Ki-67-status var signifikant korreleret med den højere Oncotype DX-risiko for recidivgruppe (lav versus høj, ) . Hvis en genomisk analyse ikke er tilgængelig, kan patienten med lavt PgR- og højt Ki-67-ekspression i aktiv behandling overvejes i ER-positiv og HER2-negativ brystkræft. Der er dog behov for yderligere arbejde, herunder uafhængig validering og muligvis en prospektiv undersøgelse, før disse resultater kan tages i retning af klinisk oversættelse.

Vores papir rejser flere yderligere spørgsmål. Selv om Ki-67 er blevet undersøgt som en prognostisk markør i brystkræft i mere end to årtier, er der kontroverser omkring de metoder, der anvendes til bestemmelse af dens udtryk, og den generelle analytiske validitet af offentliggjorte resultater. Analytisk validitet henviser til en test’ evne til at give reproducerbare og nøjagtige resultater. For at en markør kan have prognostisk og prædiktiv værdi, er det vigtigt at finde et evidensbaseret “optimalt” cutoffpunkt. En af grundene til kontroverserne omkring brugen af Ki-67 som markør er således, at der ikke findes en universelt accepteret standardgrænseværdi, hvilket har resulteret i, at forskellige laboratorier anvender forskellige specifikke tærskelværdier. Vores institution har tidligere vist, at en cutoff-værdi på 10 % giver de bedste prognoseforudsigelsesresultater . Denne værdi adskiller sig fra den grænseværdi, der blev præsenteret i Saint Gallen Consensus, som i 2011 definerede “lavproliferationstumorer” som tumorer med et Ki-67-indeks <14 % , en grænseværdi, der blev fastsat ved sammenligning med den molekylære test PAM50 intrinsic multigene-test til klassificering af luminal cancer . På Saint Gallen-konferencen i 2013 stemte et flertal af paneldeltagerne for at hæve den tærskel, der indikerer høj Ki-67-status, til ≥20 %. En endelig definition af et enkelt skæringspunkt ved Saint Gallen-konsensus har været vanskelig at fastlægge på grund af den kontinuerlige fordeling af Ki-67 og analytiske og præanalytiske hindringer for en standardiseret vurdering . Den grænseværdi, der anvendes af vores institut, er passende for vores forskning, men drøftelserne om standardisering af Ki-67-vurderinger for yderligere at reducere interobserver-variabiliteten vil fortsætte. Det skal analyseres for at se, om de resultater, der er rapporteret med hensyn til den prognostiske værdi af Ki-67, ville blive gengivet, hvis 14 % eller 20 % blev anvendt i stedet for 10 %. Da cutoff-værdien for Ki-67 blev sat til 14 %, var der ingen forskel i henhold til Ki-67. RFS efter Ki-67 havde ingen statistisk signifikans (; bilag 1) og viste heller ingen forskel mellem lavt og højt Ki-67 i henhold til PgR-ekspressionsundergrupperne (; bilag 2a, ; bilag 2b). Den bedste strategi er at bruge Ki-67 som en kontinuerlig markør, der afspejler biologien for tumorproliferation. Desuden bør behandlingsbeslutningen for de enkelte patienter ikke afhænge af små forskelle i Ki-67 omkring et givet grænsepunkt.

Så vidt vi ved, er dette en af de største retrospektive undersøgelser, der analyserer data fra et klinisk kræftregister af høj kvalitet om rutinemæssig anvendelse og prognostisk betydning af Ki-67. Selv om den er retrospektiv, har den den fordel, at den omfatter en ikke-selekteret, ikke-metastatisk brystkræftpopulation uden selektionsbias. Især blev patologi- og biomarkøranalyser udført prospektivt i et enkelt, akkrediteret laboratorium og repræsenterer således en “reel” vurdering af værdien af IHC i klinisk praksis.

Trods de forskellige begrænsninger af Ki-67 som markør er dens kliniske anvendelse inden for brystkræftområdet blevet vedtaget af flere årsager. Den anvendes til at skelne mellem luminale tumorer og anses for at være en prognostisk faktor. Evaluering af Ki-67 ved IHC er billig og let at gennemføre uden investeringer i sofistikeret udstyr, hvilket fører til det attraktive koncept om Ki-67 som en billig biomarkør. Betydningen af klinisk fleksibilitet er fundamental i betragtning af usikkerheden omkring skræddersyning af forskellige kemoterapimuligheder til det enkelte tilfælde, hvilket understreger vigtigheden af at etablere en mere præcis rolle for Ki-67.

I denne undersøgelse fandt vi, at Ki-67 kun er en effektiv prognostisk markør i forbindelse med lav PgR-status. Vi fandt endvidere, at patienter med lav PgR og højt Ki-67-ekspression havde den dårligste prognose med hensyn til RFS. Ud fra et globalt perspektiv vil genomiske signaturer fortsat være vanskelige at få adgang til i en overskuelig fremtid for de fleste patienter. Aktiv behandling kan betragtes som standardbehandling i tilfælde af tidlig ER-positiv og HER2-negativ brystkræft, der opfylder betingelserne for lav PgR og høj Ki-67.

5. Konklusioner

Vores resultater viser, at Ki-67 kun har prognostisk værdi for recidiv og overlevelse hos patienter med ER-positiv og HER2-negativ tidlig brystkræft i forbindelse med et lavt PgR-ekspressionsniveau. Således bør PgR-ekspression også tages i betragtning ved vurdering af prognosen for brystkræftpatienter ved hjælp af Ki-67.

Databesiddelse

De demografiske og kliniske data, der er indsamlet med henblik på den statistiske analyse til støtte for resultaterne af denne undersøgelse, er tilgængelige fra den tilsvarende forfatter efter anmodning.

Interessekonflikter

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter i forbindelse med offentliggørelsen af denne artikel.

Supplementært materiale

Bilag 1: Recidivfri overlevelse (RFS) i henhold til Ki-67-indekset ved en 14 % cutoff-værdi. Tillæg 2a: Recidivfri overlevelse (RFS) i henhold til Ki-67-indekset (14 % cutoff-værdi) i undergruppen med lav progesteronreceptor. Tillæg 2b: RFS i henhold til Ki-67 (14 % cutoff-værdi) i undergruppen med høj progesteronreceptor. (Supplerende materialer)