1 INDLEDNING
Phospholipid bilayer membraner (BLM’er) udgør et nyttigt modelsystem til at undersøge grundlæggende aspekter af lipidbilayer-komponenterne i biologiske cellemembraner og især til at undersøge deres elastiske egenskaber. De er selvsamlede strukturer af amfipatiske molekyler med fysiske egenskaber, der minder meget om smektiske flydende krystaller . Lipiddobbeltlagsmatrixen er i stand til at inkorporere både hydrofobiske og amfipatiske molekyler som proteiner, andre lipider, peptider, steroider og cosurfaktanter. De elastiske egenskaber ved lipidmembraner, der betragtes som kontinuerlige medier, er blevet anvendt i en række undersøgelser, der spænder fra lokale fænomener som lipid-lipid- , lipid-protein- og protein-protein-interaktioner til formfluktuationer i hele celler . Desuden opretholdes dobbeltlagets flydende kulbrintekarakter af intermolekylære interaktioner mellem fosfolipiderne på nanoskopisk skala: elektrostatiske og dipol-dipol-interaktioner mellem de polære hovedgrupper , interaktioner formidlet af vandmolekyler og van der Waals-dispersionsinteraktioner mellem kulbrintekæderne .
Overfladerne i en BLM er hverken perfekt plane eller stive . BLM-systemet er en kvasi todimensional fleksibel struktur, der kontinuerligt gennemgår en række konformationelle og dynamiske overgange . Desuden er kunstige og naturlige BLM’er ikke isolerende systemer, men gennemtrængelige for vand og elektrolytter, der diffunderer gennem en række forskellige transmembranporer.
Stokastiske transmembranporer genereres af en af følgende mekanismer: tilfældige og forudindtagede termiske fluktuationer (termoporation) og elektrisk udløsning (elektroporation). Lipidmolekyler inde i BLM følger tre forskellige kategorier af tilfældige termiske bevægelser: laterale translationer, parallelt med bilagsoverfladen, med den laterale diffusionskoefficient i størrelsesordenen 10-7 m2s-1 (Dl) , svingninger og rotationer omkring lipidakserne vinkelret på bilagsoverfladen .
Laterale translationer med tilfældige retninger inducerer lokale fluktuationer af tætheden af lipidens polære hovedgrupper ved bilagsoverfladerne. Derfor afslører et øjebliksbillede af dobbeltlagets overflade lokale domæner af nanoskopisk dimension med en højere tæthed af polære hovedgrupper (dvs. klynger) samt zoner med en lavere tæthed. Under visse fysiske forhold i BLM (pH, temperatur, lipidkomponenter, elektrokemisk potentiale osv.) repræsenterer de sidstnævnte zoner små lokale defekter (dvs. tomrum) i membranen. I disse domæner kan vandmolekylerne trænge ind i den hydrofobiske matrix i dobbeltlaget. Lad os se på to uafhængige defekter fra hvert monolag, som er rettet i en vinkelret retning på membranens overflade. De kan danne en cylindrisk hydrofob pore med den indre overflade flankeret af lipidernes hydrofobiske kæder. Derfor er disse typer af forbigående porer af hydrofobisk karakter. Det er også muligt, at de polære hovedgrupper, der er placeret i nærheden af en hydrofob pore, kan rotere indad mod dens indre. I så fald vil porernes indre hydrofobiske overflade blive belagt med polære hovedgrupper. Disse porer har således en hydrofil karakter, har ikke længere en cylindrisk geometri og er mere stabile end de hydrofobiske porer . Med andre ord er de tilfældige termiske fluktuationer i den polære hovedgruppetæthed i de to monolag af BLM i stand til at generere stokastiske transmembranporer.
Forsekomsten af hydrofobiske tykkelsesfluktuationer i BLM blev påvist både teoretisk og eksperimentelt. Dette blev opnået ved bestemmelse af værdierne for dobbeltlagstykkelse (h) ud fra tre uafhængige procedurer: elektriske kapacitansmålinger (hc) , optiske reflektionsmålinger (hr) , og direkte beregning (hav). Tanford (1980) beregnede dobbeltlagstykkelsen ved hjælp af følgende formel: hav = Nl M/ρ, hvor Nl, M og ρ er henholdsvis antallet af lipider pr. arealenhed, molekylvægten af de hydrofobiske kæder og tætheden af den hydrofobiske zone. På grund af “tykkelsessvingninger” i de hydrofobiske områder bør hc være lig med hav, mens de i dette tilfælde begge bør være mindre end hr med tykkelsen af det polære lag (htp): hc ≅ hav = hr-htp. Hvis lipiddobbeltlaget ville have en ensartet tykkelse, skulle hc være lig med hav. I tilfælde af BLM, der består af en binær blanding af lipider, sker der en selektiv sammenslutning mellem fosfolipiderne efter fremkomsten af fosfolipiddomæner. Deres tykkelse er afhængig af længden af lipidkomponenternes kulbrintekæde . Popescu et al. (1991) påviste, at der opstår stokastiske porer i BLM’er som følge af svingninger i tykkelsen af dobbeltlaget. Højden af energibarrieren for membranperforering efter en sådan mekanisme er dog stor (ca. 91 kT, hvor k og T er henholdsvis Boltzmannkonstanten og den absolutte temperatur). I dette tilfælde har porens geometriske profil en elliptisk toroidal form. Det blev også vist, at en sådan transmebrane-porer kan udvikle sig til en stabil tilstand . De resultater, der blev opnået med denne model, var ret overraskende på grund af den hurtige tidsskala for lukning af statistiske porer i membraner. To år senere har Zhelev og Needham (1993) skabt store, kvasistabile porer i lipid-dobbeltlagsvesikler, hvilket er i overensstemmelse med den tidligere modelforudsigelse . Membranens modstand mod brud i form af en linjespænding for en stor pore i tolagede vesikler blev beregnet af Moroz og Nelson (1997) .
Stokastiske transmembranporer kan også dannes ved biased termisk bevægelse af lipider . Denne mekanisme kaldes undertiden termoporation. Porerne opstår i membranen via en termisk induceret aktiveringsproces. Alternativt kan aktiveringsprocessen for poredannelse induceres via et eksternt elektrisk felt (også kaldet elektroporation) . Den pore, der dannes ved elektroporation, er større og mere stabil . Elektroporationsmekanismen blev foreslået til levering af lægemidler og gener til celler og væv.
Transmembranproteinporer dannes af proteinholdige systemer, der dækker et bredt spektrum fra små peptidkanaler (f.eks. gramicidin, alamethicin, melittin osv.) til store multimeriske proteinkanaler, der er samlet. Da disse porer er store og vandfyldte, kan de hydrofile stoffer, herunder ioner, diffundere gennem dem og dermed opløse membranens elektriske potentiale. Transmembranproteinporer består af integrale proteiner fra to store strukturelle klasser: (1) selektive kanaler dannet af bundtede transmembran a-helikale strukturer og (2) selektive kanaler, porer og poriner dannet af monomere (f.eks. OmpG), dimeriske (f.eks. selektive Cl- kanaler), trimeriske (f.eks. OmpF) eller multimere transmembran-ß-barrel strukturer (f.eks. α-hemolysin, leukocidiner, cytolysiner) . Lipiddobbeltlaget kan anvendes som et in vitro-system til undersøgelse af disse proteinkanaler, når de er rekonstitueret til en funktionel membran . Desuden kan BLM’erne anvendes som et redskab til membranproteinkonstruktion og dens anvendelser inden for enten enkeltmolekylær biofysik eller bioteknologisk område .
I et andet eksempel danner colicin Ia, et protein, der udskilles af Escherichia coli, spændingsledede ionkanaler både i den indre membran af målbakterier og i plane BLM’er . Colicin Ia er en membrantransportør, der tilhører den klasse af bakterietoksiner, der har samme strategi: de indsættes i membranen hos de andre næringsstofkonkurrerende bakterier, hvorved der dannes porer af store dimensioner. Disse porer beskadiger derfor det elektrokemiske membranpotentiale og fremkalder i sidste ende disse konkurrerende bakteriers død. Sammenlignet med de ovenfor nævnte stokastiske porer har de proteinholdige porer en anden dannelsesmekanisme og også andre egenskaber. Mens en stokastisk pore “glemmer” sin dannelsesmekanisme, synes nogle af transmembranproteinporerne (f.eks. colicin Ia) at udvise “hukommelsesvirkninger”, i det mindste under påvirkning af en bestemt sekvens af impulser, der anvendes til elektrisk stimulering af BLM .
Genetiske porer blev påvist i væggen af sinusoidkar fra pattedyrsleveren. Endothelcellerne i disse kar har talrige sipladeporer . Disse porer med en diameter på ca. 0,1 μm gør det muligt for en del af blodplasmaet og chylomikroner at passere fra sinusoidalrummet til Disse-rummet. Derfor kontrollerer endothelporerne udvekslingen af væsker, opløste stoffer og partikler mellem det sinusoidale blod og Disse-rummet.
I dette arbejde har vi anvendt elasticitetsteorien for kontinuerlige medier til at beskrive forekomsten af stokastiske porer på tværs af plane BLM’er.