Free Press

P74-26 Major Capsid Protein bruger unikke arkitektoniske træk – lassos, ringe og flaps – til at øge stabiliteten af capsidet. Vi observerer forbedrede hydrofobiske interaktioner ved grænsefladerne mellem underenhederne i capsidet. De hydrofobiske interaktioner anslås at være >2 gange højere for P74-26 end for andre mesofile homologer (Supplerende tabeller 3 og 4). Denne observation kan delvist forklare den forbedrede termostabilitet for P74-26-kapsiden, da den hydrofobiske effekt øges i styrke ved høj temperatur32. I modsætning hertil observerer vi ingen signifikante ændringer i antallet af hydrogenbindinger eller saltbroer (Supplerende tabeller 3 og 4), andre interaktioner, der er set at give termostabilitet for nogle globulære proteiner33,34,35,36.

Vi var ikke specielt overrasket over at finde øgede hydrofobiske interaktioner i P74-26-kapsiden. Talrige undersøgelser af termofile globulære proteiner viser øgede hydrofobiske kræfter som en vigtig bidragyder til termisk stabilitet33,37,38,39,40. Der er imidlertid to ting, der gør P74-26-kapsiden til et unikt modelsystem: (1) et højt indre tryk fra tæt pakket DNA inducerer mekanisk stress i capsidet7,8,27 og (2) det er en selvsamlingsstruktur, hvor arkitekturen og topologien mellem underenhederne spiller en vigtig rolle for den samlede stabilitet. Vi kan udlede disse principper ved at sammenligne P74-26-strukturen med strukturen hos talrige mesofile homologer.

Vi finder, at P74-26-kapsiden stabiliseres af flere loops og forlængelser, der danner topologiske forbindelser mellem underenhederne. Den unikke E-loop-lasso lægger sig til G-loop’en og P-domænet af en nabo-MCP, som fungerer som en anhænger til topologisk fastgørelse af lasso’en. Desuden omkranser N- og C-armen sammen med Dec-armen fuldstændigt E-loop β-strengene, hvilket er et andet arkitektonisk element, der er unikt for P74-26 (fig. 5e). E-loopet er således ringet mod basen og lassoed mod spidsen.

En anden lasso dannes af N-armen, som danner både intra- og inter-capsomer interaktioner. N-armen binder sig til E-loopet af en nabo-MCP inden for en kapsomer gennem den øverste armstreng, underarmshelixen og håndregionen (fig. 5a, c). Desuden stabiliserer albuen, underarmen og hånden capsomer-capsomer-interaktioner ved at binde sig til DecP74-26 og en MCP-underenhed, der ligger på tværs af de tofoldede/kvasi-twofoldede akser (Fig. 6a, b). Mens N-armen teknisk set ikke er en lukket løkke, lukker P74-26 effektivt løkken ved hjælp af den unikke S-løkke for at fastlåse positionen af underarm- og håndregionerne (Fig. 6c). Vi finder ingen lignende N-arm-lasso-arkitektur i mesofile Caudovirus31,41,42,42,43,44,45,46, hvilket tyder på, at denne arkitektur er vigtig for at forbedre capsidstabiliteten.

Selv om lassos ikke findes i andre Caudovirus, indeholder de fjernt beslægtede herpesvirus en analog lasso-arkitektur i N-armen af HK97-foldningen47,48,49. I lighed med N-armen af P74-26 er herpesvirus N-arm-lassos ikke ægte lukkede sløjfer. På trods af denne tilsyneladende lighed fungerer herpesvirus-lassos forskelligt. De stabiliserer udelukkende inter-capsomer-interaktioner, hvorimod P74-26’s N-arm-lasso stabiliserer både intra-capsomer- og inter-capsomer-interaktioner. Desuden udviser pentonerne i herpesviruskapsiderne ikke lasso-interaktioner, og interaktionerne er variable inden for hexon-underenhederne, mens P74-26 har næsten identiske lasso-interaktioner i både pentoner og hexoner. Disse observationer tyder på, at lasso-arkitekturen sandsynligvis har udviklet sig uafhængigt af hinanden og fremhæver fleksibiliteten af topologiske stabiliseringsmekanismer. Vi opstiller den hypotese, at den forlængbare arm-arkitektur letter evolutionen af stærkere interaktioner i selvsamlende systemer som f.eks. capsider. Disse åbne sløjfer kan let forbedres gennem seriel forlængelse af enkeltresidueforlængelse. Måske er denne lethed i evolutionen grunden til, at forlængede armlassos findes i både P74-26 og herpesvirusser. Disse forlængede lassos ligner N- og C-terminale forlængelser, der formidler samling i andre vira (f.eks. C-terminale forlængelser i SV40 kapsidcoatproteiner50). Vi forventer, at disse typer forlængede lassos kan være nyttige til at konstruere mere stabile capsider og andre selvsamlende partikler.

En anden fordel ved lasso-arkitekturen er, at den kan antage en mindre udvidet konformation. P74-26 MCP har to lassos i hver ende af HK97-foldningen, som begge formodentlig er til stede i det meget mindre procapsid. Ved at bruge disse lassostrukturer kan P74-26 bevare en høj stabilitet, samtidig med at den giver konformationel fleksibilitet til at udvide sig under modningen. Vi antager, at lassoerne er mindre udstrakte i procapsidet; ved capsidudvidelse når lassoerne deres fulde udstrækning, hvor de låser sig fast på deres plads. Den fulde forlængelse, der er observeret i det modne capsid, ville give spændingsmæssig integritet, som vi diskuterer nedenfor.

P74-26 bruger sammenvævede flaps til topologisk at stabilisere inter-capsomerkontakter. T-sløjfen stabiliserer inter-capsomer-interaktioner ved at sætte sig ind i en rille på P-domænet af en MCP-underenhed i en nabo capsomer. Disse T-loop-interaktioner findes omkring de tre/kvasi-tredobbelte akser langs capsidets inderside (Fig. 7b; Supplerende Fig. 7b). På samme måde stabiliseres de dobbelte/kvasi-dobbelt dobbelte interaktioner mellem kapsomererne på capsidets yderside af N-armenes indbyrdes forbundne arrangement (fig. 7c; supplerende fig. 7a). Disse overlappende strukturer ligner den indbyrdes overlappende placering af flapper i toppen af en kasse, der bevæger sig. På denne måde stabiliseres capsidets udvendige og indvendige flader af to særskilte interagerende klapinteraktioner. Vi foreslår, at de bevægelige kassearrangementer, der ses ved symmetri- og kvasi-symmetriakser, i høj grad styrker capsidet mod internt tryk, fordi de er topologisk udfordrende at forstyrre. Imidlertid er disse arrangementer formodentlig også udfordrende at samle, hvilket rejser det vigtige spørgsmål om, hvordan P74-26-kapsiden samles med en interleaved arkitektur.

P74-26-dekorationsproteinet antager ligeledes et unikt strukturelt arrangement, der bidrager væsentligt til kapsidets termostabilitet. Dekorationsproteiner øger capsidstabiliteten28,29,51 , selv om der er blevet postuleret yderligere roller52. De trefoldige/kvasi-trefoldige akser stabiliseres af DecP74-26-trimeren. Sammenlignet med mesofile Caudovirusser interagerer DecP74-26-trimeren med flere underenheder over et meget større interaktionsområde (fig. 8a). Det samlede interaktionsområde pr. DecP74-26-underenhed er ganske bemærkelsesværdigt: ~4100;Å2 for et protein med 146 residuer. Vores tidligere undersøgelse viste, at DecP74-26 er væsentligt mere stabilt end sine mesofile homologer, og denne stabilisering sker primært gennem dannelse af en ekstraordinært tæt trimer23. Imidlertid tegner trimeriseringsinteraktionerne sig kun for en lille brøkdel af det samlede DecP74-26-interaktionsområde (~18% af det samlede interaktionsområde pr. DecP74-26-underenhed). Dette tyder på, at DecP74-26-interaktionen med capsidet bidrager med en væsentlig del af stabiliteten.

Interaktioner mellem DecP74-26-trimere danner et bur, der holder capsidet sammen (Fig. 8b). Dette arrangement er unikt for P74-26. For eksempel bruger fager lambda og TW1 en meget lignende Decoration Protein fold23, men interaktionen mellem deres Dec-arm og andre capsidproteiner er meget mere begrænset29,44. Desuden forbinder det ubeslægtede dekorationsprotein fra fage L ikke nabotrimere, og det mangler faktisk ved de kvasi-trefoldede akser52. T4-fagen er dekoreret med Soc-proteinet, der interagerer med nabo-Soc-underenhederne ved de tre- og kvasi-tre-foldede akser; Soc er imidlertid til stede i forholdsvis lav belægning (~50 %), så buret er ufuldstændigt41. Da dekorationsproteiner normalt er fraværende i procapsidet29 , forventer vi, at DecP74-26-buret ville samles kooperativt ved capsidudvidelse for at stabilisere capsidet. Fremtidige eksperimenter vil afhøre den rolle, som kooperativitet spiller i samling og stabilitet.

De arkitektoniske forbedringer i P74-26 MCP og Dec giver stabilisering mod højt indre tryk. Hvordan virker kræfter fra internt tryk på capsidet, og hvordan modstår capsidarkitekturen disse belastninger? Hvis vi antager, at trykket fra indkapslet DNA er fordelt ensartet rundt om det isometriske capsid, så oplever alle punkter på capsidet en kraftvektor, der er vinkelret på capsidets overflade. Analogt hermed oplever capsidet kræfter, der svarer til kræfterne i en ballon. Det indre tryk forårsager således laterale spændinger på capsid-interaktioner. Selv om det høje indre tryk, som fagen udviser, udfordrer capsidstabiliteten, kan det give mulighed for stabilitetsmekanismer, der er baseret på tensegrity. Det er muligt, at det indre tryk kan udnyttes til at frembringe en partikel, der stabiliseres ved hjælp af stress på de enkelte underenheder. Til støtte for dette kan picornaviruskapsider, som kæmper med betydeligt mindre internt tryk, stabiliseres ved mindre modifikationer af kapsidet53.

Arkitekturen af P74-26-kapsiden er konstrueret til at modstå lateral stress gennem tensional integritet. Spændingsintegritet eller tensegrity er en generaliseret mekanisme for arkitektonisk stabilitet, der involverer strukturerede regioner, der holdes sammen af et netværk af fleksible elementer, der er under kontinuerlig spænding54. I P74-26-kapsiden er A- og P-domænerne de strukturerede regioner, og lassos og de forlængede arme er de fleksible elementer, der overfører spændinger. E-sløjfens lasso vil f.eks. blive spændt mod den koblingspæl, der dannes af G-sløjfen og naboens P-domæne. På samme måde danner N-armen en lasso, hvis ende holdes på plads af S-løjpen, der låser sig fast i rillen mellem underarmen og hånden (fig. 6c). Vi forudsiger således, at S-sløjfen vil udvise kendetegnene for en catch-binding, en ikke-kovalent binding, som bliver stærkere under spænding55. Desuden indeholder P74-26-kapsiden flere flapper, der er interleave med hinanden. Disse interaktioner vil topologisk set modstå de laterale og langsgående spændinger fra det indre tryk. Som helhed bruger disse lasso- og klapelementer spænding til at modstå strukturelt svigt i capsidet. Den tensegrity-mekanisme, der er observeret her, er blot et mere udbygget eksempel på capsid tensegrity, som Caspar foreslog for mange år siden56.

Lasso-, flap- og arminteraktionerne er placeret således, at det interne tryk fordeler spændingen over flere bindinger. E-sløjfen β-bladet oplever f.eks. kræfter langs bladets akse. Således er alle bindinger, der holder arket sammen, under spænding i stedet for i den ortogonale geometri, hvor spændingen kun er på bindingerne i enden af arket. Kapsidbrud ville kræve en samtidig afbrydelse af mange bindinger (en forskydningsgeometri), snarere end en udpakningsgeometri, hvor bindingerne brister en ad gangen57. Banebrydende undersøgelser af enkeltmolekyler har vist, at en forskydningsgeometri kræver meget større kræfter for at bryde op, end når kræfterne virker i en “unzipping”-geometri58,59,60 . P74-26-kapsiden er således konstrueret således, at laterale kræfter virker i en forskydningsgeometri, hvilket resulterer i høj tensegrity.

Ud over den unikke stabiliserende arkitektur af kapsidet anvender P74-26 også en ikke-kanonisk mekanisme til ændring af kapsidets kapacitet. P74-26’s capsid er større end i de fleste Caudovirus’, hvilket korrelerer med dens unormalt store genom. De fleste T = 7 Caudovirusser har genomstørrelser på mellem 30 og 50 kb (Supplerende tabel 2), mens fagen P74-26’s genom er næsten dobbelt så langt, nemlig 83 kb24. På grundlag af genomstørrelsen havde vi forudsagt, at capsidet ville være T = 12 (gennemsnitlig genomstørrelse ~80 kb61 ), selv om T = 9 eller T = 13 ville have været muligt (gennemsnitlig genomstørrelse ~70 eller ~120 kb, henholdsvis). P74-26-kapsiden opnår denne større størrelse ved at øge kapsomerens størrelse betydeligt snarere end ved at ændre den icosaedriske kompleksitet. Capsomeren er større, fordi P74-26 MCP’en dækker mere overfladeareal end normalt, på trods af en typisk længde for MCP. Som følge heraf er capsomeren lidt tyndere end normalt (fig. 4b). Antallet af rester i MCP forudsiger således ikke det samlede dækkede areal, og genomstørrelsen forudsiger ikke trianguleringstallet.

For nylig bestemte Bayfield et al.62 strukturen af en nært beslægtet T = 7 termofil fage, som på samme måde bruger forstørrede capsomere til at øge capsidkapaciteten. Så vidt vi ved, er dette en ikke-kanonisk mekanisme til at øge kapsidkapaciteten. Der findes to klassiske mekanismer til at forstørre et capsid: (1) forøgelse af trianguleringstallet og (2) omdannelse af et isometrisk til prolate hoved. I det første tilfælde tilføjes hexoner på tværs af alle capsidets flader, mens der i det andet tilfælde tilføjes hexoner på tværs af ti af de icosaedriske flader, således at capsidet forlænges i én dimension (fig. 9). I begge tilfælde forbliver capsiderne af samme størrelse. Her har vi identificeret en tredje mekanisme til udvikling af et større capsid: forøgelse af capsomerens størrelse.

Disse tre mekanismer har meget forskellige evolutionære barrierer. De to klassiske mekanismer kan implementeres gennem simple mutationer og er blevet observeret adskillige gange. I mange vira ændrer simple punktmutationer trianguleringstallet5,63,64. Desuden kan trianguleringstallet i nogle kapsider ændres uden at ændre MCP-sekvensen3,65,66. Ligeledes omdanner enkelte punktmutationer i T4-fagen capsidet fra prolat til isometrisk eller genererer kæmpehoveder, hvor den lange akse af det prolatede hoved er forlænget4,67. Derfor synes de evolutionære barrierer for ændring af capsidvolumen gennem de to klassiske mekanismer at være ret lave. I modsætning hertil kræver den strategi med forstørrede capsomer, der er identificeret her, flere omfattende ændringer af sekvenserne af capsidproteiner. Det større P74-26-kapsid kræver store ændringer i de otte separate modifikationer af MCP-strukturen samt Dec-armen (fig. 3a, b og 4c, d). Dette rejser spørgsmålet: Hvorfor benyttede fagen P74-26 denne tilsyneladende mere udfordrende evolutionære strategi i stedet for de lettere, klassiske strategier? Hvilke begrænsninger forhindrede evolutionen af et større capsid gennem de klassiske ruter?

Vores første hypotese er, at de lassos, flaps og arme, der stabiliserer P74-26-kapsiden, kræver en større kapsomer for at fungere. Det er muligt, at lassos har brug for ekstra plads for at åbne sig nok til, at en anhængerstruktur kan indsættes. På samme måde kan flapperne og armene kræve en vis længde for at kunne udløse deres stabiliserende aktivitet. Hvis dette var tilfældet, ville de arkitektoniske elementer, der stabiliserer capsidet, kræve større end normale capsomere. I dette scenario er den større capsomer det udvalgte strukturelle træk, og T = 7-geometrien er en spandrel: en biologisk struktur, der er et biprodukt af evolutionen snarere end et resultat af direkte udvælgelse68. Vi går dog ikke ind for denne hypotese, fordi lassos findes i herpesvirus, hvor HK97-foldningen er en typisk størrelse (Herpesvirus-MCP’er har flere andre tårndomæner, der øger størrelsen, men disse domæner er ikke en del af hovedcapsidgulvet og bidrager ikke til HK97-foldningen49). Desuden indeholder andre Caudovirus-MCP’er lange N-arme (f.eks. Sf6-fag31) eller E-sløjfer, der er åbnet næsten lige så bredt som P74-26 (f.eks. P22-fag43), men disse proteiner er af typisk størrelse. Ikke desto mindre er denne hypotese fortsat uprøvet.

En anden hypotese er, at genomstørrelsen og kapsidkapaciteten har udviklet sig sammen gennem små samtidige stigninger. Hvis den forfødte fage udviklede et lidt større genom, end der kan være plads til i capsidet, kan der være et selektivt pres for et lidt større capsid. En forøgelse af T-nummeret eller overgangen til et prolate hoved øger kapsidvolumenet betydeligt, hvilket resulterer i store fald i det indre tryk. Disse overgange kan frarådes, fordi det indre tryk skal opretholdes for at sikre infektion26. For at undgå store ændringer i det indre tryk kan større capsomer langsomt coevolvere med et større genom.

Vores sidste hypotese er, at capsidgeometrien har en direkte effekt på den samlede capsidstabilitet. Vi har den hypotese, at T = 7-geometrien i sagens natur er mere stabil end højere trianguleringstal på grund af variable konformationer af hexoner. Alle capsider, der er T = 9 eller højere, har mere end én type hexon til stede, mens alle capsider T ≤ 7 har præcis én type hexon (undtagen T = 1, som ikke har nogen hexoner69,70). T = 7 har f.eks. en enkelt-pucker hexonkonformation, mens T = 9 har både vingede og flade hexoner (Supplerende figur 11a, b). Vi bemærker også, at prolate capsider har flere typer hexoner (generelt tre eller flere hexonkonformationer; fig. 9). Således skal de vigtigste capsidproteiner i T > 7-virusser rumme hexonkonformationsheterogeniteten, hvilket kan påvirke stabiliteten negativt.

Vi opstiller den hypotese, at T = 7-geometrien er den højeste kompleksitet (dvs. største størrelse), der er iboende stabil. Mere komplekse geometrier ville indføre ustabilitet gennem variation i hexonkonformationen. Denne iboende ustabilitet kan kræve ekstra stabiliseringsmekanismer for at afbøde den, f.eks. dekorationsproteiner til at cementere strukturen på plads. Vi forestiller os to ulemper ved T > 7-geometrien, som ikke gensidigt udelukker hinanden. For det første skal hver af de separate hexonkonformationer forblive funktionelle og stabile, hvilket vil begrænse udviklingen af MCP-proteiner med henblik på større stabilitet. Den anden fordel er, at et lavere trianguleringstal resulterer i færre grænseflader mellem underenhederne, hvilket minimerer antallet af svage punkter i capsidet. Til støtte for denne hypotese pakker den ekstremofile, arkæale virus HSTV-2 (Halorubrum sodomense tailed virus 2) sit ~68 kb-genom ind i et T = 7-hoved71. HSTV-2 anvender et capsid, der er større end normalt, og har også trimeriske dekorationsproteiner, der sidder på de trefoldige/kvasi-trefoldige akser. Det faktum, at denne mekanisme til udvidelse af capsidet kun er blevet observeret hos ekstremofile, understøtter idéen om, at T = 7-geometrien har en gavnlig virkning på stabiliteten. Som yderligere støtte for vores hypotese anvender alle kendte T > 7-kapsider dekorationsproteiner (så vidt vi ved), mens mange T = 7-virus mangler dekorationsproteiner.

Hvis forskellige trianguleringstal har forskellig iboende stabilitet, ville det antyde, at hver geometri udviser svage punkter i forskellige regioner af kapsiden, som det er blevet forudsagt fra teoretisk arbejde72. Vi stiller den hypotese, at de trefoldige/kvasi-trefoldige akser repræsenterer de svage punkter i et T = 7-gitter. Til støtte for denne hypotese findes dekorationsproteiner fra T = 7-caudovirus almindeligvis ved de trefoldige/kvasi-trefoldige akser (Supplerende tabel 2)29,44,52. Desuden stabiliseres disse akser ved hjælp af kovalente tværbindinger i HK97-fagen45 og T-loop-flapper i P74-26 (fig. 7b). For at undersøge denne idé yderligere bemærker vi, at T = 9 fager også bruger dekorationsproteiner ved de trefoldige akser73,74 , mens T = 12 og T = 13 fager bruger dekorationsproteiner ved centrene af kapsomere61,75,76.

Vi bemærker, at alle vores analyser primært har fokuseret på Caudovirus. Disse virus nedbryder generelt ikke deres kapsider som en del af deres livscyklus, så kapsidet har ikke noget selektivt pres for at være labilt. Faktisk udgør det høje tryk fra pakket DNA et højt selektivt pres for at udvikle stabile kapsider. Det er sandsynligt, at andre virustyper anvender andre stabilitetsmekanismer, især virus, der nedbryder deres kapsider som en nødvendig del af deres livscyklus.