3.1.2 Azidas
La azida está considerada como uno de los grupos más adecuados para las reacciones bioortogonales y para el propósito de la química de clic. En contraste con la cetona y el aldehído, apenas hay azidas en los sistemas biológicos. Las azidas poseen una gran energía intrínseca pero no tienen un socio de reacción natural (King y Wagner, 2014), tienen tamaños pequeños y una carga global neutra, y finalmente son cinéticamente estables en condiciones fisiológicas.
La ligadura de Staudinger (Staudinger y Hauser, 1921) parece ser un buen candidato para las reacciones de bioconjugación utilizando azidas. En esta reacción, las azidas reaccionan con reactivos de trifenilfosfina que contienen una trampa electrófila para producir un intermedio de aza-ilida que reacciona con el grupo carbonilo del éster electrófilo formando un anillo de cinco miembros que se somete a hidrólisis para generar un enlace amídico estable final (Fig. 5.6A) (Steen Redeker et al., 2013; Staudinger y Hauser, 1921). Poco después se describió una nueva variante de esta reacción (King y Wagner, 2014; Saxon y Bertozzi, 2000; Saxon et al., 2000; Nilsson et al., 2000), denominada «ligadura de Staudinger sin huella», en la que el producto final ligado a la amida se libera de la fracción de óxido de fosfina.
Figura 5.6. Ejemplos de reacciones de bioconjugación con azidas. (A) Ligadura de Staudinger; (B) cicloadición azida-alquino catalizada por cobre; (C) cicloadición azida-alquino promovida por la cepa; (D) cicloadición con oxanorbornadienos. UAA, aminoácidos no naturales.
La ligadura de Staudinger se ha empleado en una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, Raines et al. aplicaron esta reacción como alternativa sin cisteína a la NCL para la ligadura de péptidos (Nilsson et al., 2001) y en combinación con la NCL en el ensamblaje de ARNasa A artificial (Nilsson et al., 2005). Además, se utilizó en otras aplicaciones, como la inmovilización de proteínas en soportes sólidos para la obtención de imágenes in vitro e in vivo (Saxon y Bertozzi, 2000; Prescher et al., 2004), el etiquetado de biomoléculas in vitro e in vivo (Saxon y Bertozzi, 2000; Prescher et al, 2004; Vocadlo et al., 2003), el enriquecimiento de proteínas (Vocadlo et al., 2003) y la detección (Charron et al., 2009), así como (Lemieux et al., 2003) la modificación de proteínas.
Sin embargo, la ligadura de Staudinger tiene algunos inconvenientes. A saber, su cinética lenta (constante de velocidad de segundo orden en el rango bajo de 10-3 M-1s-1) (Lin et al., 2005), la labilidad de oxidación de los compuestos de fosfina (necesidad de utilizar concentraciones relativamente altas del reactivo de fosfina) y la potencial reactividad cruzada de las fosfinas con los disulfuros (Lang y Chin, 2014; King y Wagner, 2014).
Los azidas pueden reaccionar con alquinos en una cicloadición azida-alquino (CuAAC) catalizada por Cu(I) o en una cicloadición 1,3-dipolar (Fig. 5.6B), uno de los ejemplos más estándar de reacciones de química de clic (Rostovtsev et al., 2002; Tornøe et al., 2002). Esta reacción presenta un gran interés en las ciencias biológicas debido a su buena selectividad, alto rendimiento y condiciones de reacción suaves (temperatura ambiente en varios disolventes). Además, tanto las azidas como los alquinos se introducen en las proteínas sin afectar a su estructura y función (Steen Redeker et al., 2013). La azida y el alquino pueden formar muy rápidamente un enlace estable de 1,2,3-triazol en condiciones fisiológicas, en presencia de Cu(I). El mecanismo propuesto por Sharpless et al. (Rostovtsev et al., 2002) describe en primer lugar la introducción del alquino terminal en un acetiluro de cobre y un posterior ataque de la azida (King y Wagner, 2014). Recientemente, este mecanismo se ha perfeccionado y se ha propuesto un intermedio de cobre (Worrell et al., 2013). Los principales inconvenientes de esta reacción son las reacciones secundarias dependientes del Cu(I) y la citotoxicidad del Cu(I) (Baskin et al., 2007; Plass et al., 2011), que han limitado su aplicación principalmente para el etiquetado en el espacio extracelular (King y Wagner, 2014). El CuAAC se ha utilizado ampliamente en muchos estudios biológicos diferentes, por ejemplo, para etiquetar fosfolípidos para su obtención de imágenes in vivo (Jao et al., 2009) e in vitro (Neef y Schultz, 2009), para la remodelación de la superficie del virus (Steinmetz et al., 2009), para modificar/etiquetar proteínas in vitro e in vivo (Link y Tirrell, 2003; Ngo y Tirrell, 2011; Liu y Schultz, 2010; Deiters et al., 2003), para etiquetar ácidos nucleicos (Weisbrod y Marx, 2008) y para realizar perfiles de sonda basados en la afinidad (Speers et al., 2003).
Se han desarrollado diferentes enfoques para superar la citotoxicidad del cobre. A saber, el uso de ligandos solubles en agua para la coordinación del Cu(I), el uso de azidas orgánicas que quelan el cobre y la introducción de la deformación del anillo en la fracción de alquino. En el primer caso, los ligandos solubles en agua coordinan el Cu(I) para formar un catalizador de cobre activado capaz de promover el CuAAC a bajas concentraciones micromolares de metal reduciendo al mismo tiempo la potencial toxicidad del Cu(I) (Besanceney-Webler et al., 2011; Del Amo y Wang, 2010; Hong et al., 2009; Kennedy et al., 2011). En el segundo caso, la concentración efectiva de Cu(I) se eleva en el sitio de reacción mediante el uso de ligandos azida que contienen una fracción interna quelante de cobre (Brotherton et al., 2009; Kuang et al., 2010; Uttamapinant et al., 2012). La última estrategia implica el uso de alquinos, que han sido activados para reaccionar con una cinética mejorada en ausencia de catalizador. En este sentido, el uso de los móviles de ciclooctano aumenta la reactividad como resultado de la liberación del anillo de tensión (Steen Redeker et al., 2013; Baskin et al., 2007; Plass et al., 2011). La cicloadición azida-alquina promovida por la cepa (SPAAC) (Fig. 5.6C) se ha convertido en una poderosa herramienta no solo para el etiquetado de proteínas y anticuerpos, sino también para otras aplicaciones como el análisis Western Blot sin anticuerpos (Boutureira et al., 2015), ya que no se requieren reactivos adicionales ni metales tóxicos que puedan dañar las biomoléculas. Por ejemplo, Bertozzi et al. demostraron su aplicabilidad en la modificación de proteínas purificadas (Baskin et al., 2007). En otros experimentos, la reacción se aplicó con éxito in vitro a células de fibroblastos (Baskin et al., 2007). Además, la SPAAC se utilizó para obtener imágenes de tumores en ratones vivos con la ayuda de nanopartículas (Koo et al., 2012) y la PET de 18F, en la que el flúor se unió a la azida y a la cicloalquina (Jeon et al., 2012). Otros campos de aplicación se encontraron en la modificación de virus y el etiquetado de ADN (Qiu et al., 2013). Sin embargo, la compleja síntesis de los ciclooctinos y el hecho de que su mayor volumen e hidrofobicidad pueden afectar a la estructura y estabilidad de las proteínas (Kim et al., 2013), y su mayor activación puede promover reacciones secundarias con tioles naturales pueden considerarse como desventajas.
Las azidas de sulfonilo deficientes en electrones también pueden reaccionar con alquenos activados (oxanorbornadienos o norbornenos) en una cicloadición sin metales (Fig. 5.6D), similar a la SPAAC (Alder, 1930; Huisgen et al., 1980). Sin embargo, el producto de las cicloadiciones azida-alqueno es una triazolina relativamente inestable, a diferencia de los triazoles aromáticos formados en la clásica cicloadición click. Se utilizó un oxanorbornadieno tenso y deficiente en electrones como dipolarófilo en una reacción con azidas (van Berkel et al., 2008). En este caso, el doble enlace tenso del oxanorbornadieno reacciona con las azidas para formar una triazolina intermedia que se somete espontáneamente a una reacción de Diels-Alder retro, con liberación de furano, dando lugar a 1,2,3- o 1,4,5-triazoles estables. Esta reacción se utilizó para bioconjugar selectivamente una proteína funcionalizada con oxanorbornadieno y un péptido cíclico modificado con azida en tampones acuosos. Aunque los oxanorbornadienos son más fáciles de sintetizar que sus homólogos de ciclooctano, esta reacción de cicloadición es bastante lenta y no es totalmente quimioselectiva con respecto a otros grupos funcionales que se encuentran en las proteínas, lo que puede haber limitado su uso generalizado (Lang y Chin, 2014; van Berkel et al., 2008).