1 INTRODUCCIÓN
Las membranas de bicapa de fosfolípidos (BLM’s) representan un sistema modelo útil para examinar aspectos fundamentales de los componentes de la bicapa de lípidos de las membranas celulares biológicas y, particularmente, para investigar sus propiedades elásticas. Son estructuras autoensambladas de moléculas anfipáticas con características físicas muy similares a las de los cristales líquidos esmécticos . La matriz de bicapa lipídica es capaz de incorporar moléculas tanto hidrofóbicas como anfipáticas, como proteínas, otros lípidos, péptidos, esteroides y cosurfactantes. Las propiedades elásticas de las membranas lipídicas consideradas como medios continuos se han utilizado en diversos estudios que van desde fenómenos locales, como las interacciones lípido-lípido , lípido-proteína y proteína-proteína , hasta las fluctuaciones de forma de las células completas . Además, la naturaleza de hidrocarburo líquido de la bicapa se mantiene por las interacciones intermoleculares entre los fosfolípidos a escala nanoscópica: las interacciones electrostáticas y dipolares entre los grupos de cabeza polares , las interacciones mediadas por las moléculas de agua , y las interacciones de dispersión de Van der Waals entre las cadenas de hidrocarburos .
Las superficies de un BLM no son perfectamente planas ni rígidas . El sistema BLM es una estructura flexible casi bidimensional que experimenta continuamente una variedad de transiciones conformacionales y dinámicas . Además, los BLM artificiales y naturales no son sistemas aislantes, sino permeables para el agua y los electrolitos que se difunden a través de una diversidad de poros transmembrana.
Los poros transmembrana estocásticos se generan por cualquiera de los siguientes mecanismos: fluctuaciones térmicas aleatorias y sesgadas (termoporación), y activación eléctrica (electroporación). Las moléculas lipídicas dentro de la BLM siguen tres categorías distintas de movimientos térmicos aleatorios: traslaciones laterales, paralelas a la superficie de la bicapa, con el coeficiente de difusión lateral del orden de 10-7 m2s-1 (Dl) , oscilaciones y rotaciones alrededor de los ejes de los lípidos perpendiculares a la superficie de la bicapa .
Las traslaciones laterales con direcciones aleatorias inducen fluctuaciones locales de la densidad de los grupos de cabeza polares de los lípidos en las superficies de la bicapa. Por lo tanto, una instantánea de la superficie de la bicapa revela dominios locales de dimensión nanoscópica con una mayor densidad de grupos de cabeza polares (es decir, racimos), así como zonas con una menor densidad. Para determinadas condiciones físicas de la BLM (pH, temperatura, componentes lipídicos, potencial electroquímico, etc.), estas últimas zonas representan pequeños defectos locales (es decir, vacantes) de la membrana. En estos dominios, las moléculas de agua pueden penetrar en la matriz hidrofóbica de la bicapa. Consideremos el caso de dos defectos independientes de cada monocapa que están alineados en dirección perpendicular en la superficie de la membrana. Pueden generar un poro hidrofóbico cilíndrico con la superficie interior flanqueada por las cadenas hidrofóbicas de los lípidos. Por tanto, este tipo de poros transitorios son de naturaleza hidrofóbica. También es posible que los grupos de cabeza polares, situados en la proximidad de un poro hidrofóbico obedezcan a rotaciones hacia su interior. En este caso, la superficie interna hidrofóbica de los poros se recubrirá de grupos de cabeza polares. Así, estos poros tienen una naturaleza hidrofílica, no tienen más una geometría cilíndrica y tienen más estabilidad que los hidrofóbicos . En otras palabras, las fluctuaciones térmicas aleatorias de la densidad de grupos de cabeza polares en las dos monocapas de BLM son capaces de generar poros transmembrana estocásticos.
La presencia de fluctuaciones de espesor hidrofóbicas en el interior de BLM fue demostrada tanto por la teoría como por el experimento. Esto se logró mediante la determinación de los valores del espesor de la bicapa (h) a partir de tres procedimientos independientes: mediciones de capacitancia eléctrica (hc) , mediciones de reflectancia óptica (hr) , y cálculo directo (hav). Tanford (1980) calculó el espesor de la bicapa mediante la siguiente fórmula hav = Nl M/ρ, donde Nl, M y ρ son el número de lípidos por unidad de superficie, el peso molecular de las cadenas hidrofóbicas y la densidad de la zona hidrofóbica, respectivamente. Debido a las «fluctuaciones de espesor» de las regiones hidrofóbicas, hc debería ser igual a hav, mientras que, en este caso, ambos deberían ser menores que hr por el espesor de la capa polar (htp): hc ≅ hav = hr-htp. Si la bicapa lipídica tuviera un espesor uniforme, entonces hc debería ser igual a hav. En el caso de la BLM compuesta por una mezcla binaria de lípidos, se produce una asociación selectiva entre los fosfolípidos tras la aparición de los dominios fosfolipídicos. Su grosor depende de la longitud de la cadena de hidrocarburos de los componentes lipídicos . Popescu et al. (1991) demostraron la aparición de poros estocásticos en las BLM debido a las fluctuaciones del espesor de la bicapa. Sin embargo, la altura de la barrera energética para la perforación de la membrana siguiendo dicho mecanismo es grande (alrededor de 91 kT, donde k y T son la constante de Boltzmann y la temperatura absoluta, respectivamente). En este caso, el perfil geométrico del poro es de forma elíptica toroidal. También se demostró que un poro transmebrana de este tipo podía evolucionar hasta un estado estable . Los resultados obtenidos por este modelo fueron bastante sorprendentes, debido a la rápida escala de tiempo para el cierre de los poros estadísticos en las membranas. Dos años más tarde, Zhelev y Needham (1993) han creado poros grandes y cuasiestables en vesículas de bicapas lipídicas, manteniendo así la predicción del modelo anterior . La resistencia de la membrana a la ruptura en términos de tensión lineal para un gran poro en vesículas bicapa fue calculada por Moroz y Nelson (1997).
Los poros transmembrana estocásticos también pueden formarse por el movimiento térmico sesgado de los lípidos . Este mecanismo se denomina a veces termoporación. Los poros aparecen en la membrana a través de un proceso de activación inducido térmicamente. Alternativamente, el proceso de activación para la formación de poros puede ser inducido a través de un campo eléctrico externo (también llamado electroporación). El poro generado por la electroporación es más grande y más estable. El mecanismo de electroporación se propuso para el suministro de fármacos y genes a las células y tejidos.
Los poros de proteínas de transmembrana están formados por sistemas proteináceos que cubren una amplia gama desde pequeños canales peptídicos (por ejemplo, gramicidina, alameticina, melitina, etc.) hasta grandes canales ensamblados multiméricos de proteínas. Como estos poros son grandes y están llenos de agua, las sustancias hidrofílicas, incluidos los iones, pueden difundirse a través de ellos, disipando así el potencial eléctrico de la membrana. Los poros de proteínas transmembrana están formados por proteínas integrales de dos grandes clases estructurales: (1) canales selectivos formados por estructuras a-helicoidales transmembrana agrupadas, y (2) canales selectivos, poros y porinas formados por estructuras ß-barril transmembrana monoméricas (por ejemplo, OmpG), diméricas (por ejemplo, canales selectivos de Cl-), triméricas (por ejemplo, OmpF) o multiméricas (por ejemplo, α-hemolisina, leucocidinas, citolisinas) . La bicapa lipídica puede utilizarse como sistema in vitro para estudiar estos canales proteicos cuando se reconstituyen en una membrana funcional . Además, las BLM pueden utilizarse como herramienta para la ingeniería de proteínas de membrana y sus aplicaciones en la biofísica de una sola molécula o en el área biotecnológica.
En otro ejemplo, la colicina Ia, una proteína secretada por Escherichia coli, forma canales iónicos activados por voltaje tanto en la membrana interna de las bacterias objetivo como en las BLM planas . La colicina Ia es un transportador de membrana que pertenece a la clase de toxinas bacterianas que comparten la misma estrategia: se insertan en la membrana de otras bacterias competidoras de nutrientes, generando así poros de grandes dimensiones. En consecuencia, estos poros dañarán el potencial electroquímico de la membrana y, finalmente, provocarán la muerte de estas bacterias competidoras. En comparación con los poros estocásticos mencionados anteriormente, los poros proteináceos tienen un mecanismo de formación diferente y también propiedades distintas. Mientras que un poro estocástico «olvida» su mecanismo de generación, algunos de los poros proteicos transmembrana (por ejemplo, la colicina Ia) parecen exhibir efectos de «memoria», al menos bajo la influencia de una secuencia específica de pulsos utilizada para la estimulación eléctrica de BLM.
Se encontraron poros proteicos en la pared de los vasos sinusoides del hígado de los mamíferos. Las células endoteliales de estos vasos tienen numerosos poros de placa cribosa . Estos poros de aproximadamente 0,1 μm de diámetro permiten que una parte del plasma sanguíneo y los quilomicrones pasen del espacio sinusoidal al espacio de Disse. Por lo tanto, los poros endoteliales controlan el intercambio de fluidos, solutos y partículas entre la sangre sinusoidal y el espacio de Disse .
En este trabajo, utilizamos la teoría de la elasticidad de los medios continuos para describir la aparición de poros estocásticos a través de BLMs planares.