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Introducción

Para proporcionar una alimentación y nutrición adecuadas a la población mundial, que se espera que alcance los 9.000 millones de personas en 2050 (http://www.unpopulation.org), el rendimiento del arroz debe aumentar al menos un 60% (FAO 2009). El arroz es el alimento básico de más de la mitad de la población mundial y esta población consumidora de arroz está aumentando a un ritmo del 1,098% anual (http://esa.un.org/wpp/Excel-Data/population.htm). El aumento de la población implica una mayor demanda de alimentos, agua y tierra en un momento en el que la base de recursos naturales para la agricultura se está degradando porque se están desviando grandes extensiones de tierra de cultivo de la producción de alimentos a la industrialización y la producción de biocombustibles. Un cambio climático imprevisible amenaza con reducir aún más las tierras viables desde el punto de vista agrícola debido a un mayor número de sequías e inundaciones (http://www.fao.org/docrep/017/aq191e/aq191e.pdf). Dado que el aumento de la población y el cambio climático global ejercen una presión cada vez mayor sobre el suministro de alimentos en el mundo, es esencial que sigamos mejorando el rendimiento de los cultivos en términos de productividad del grano para seguir el ritmo del crecimiento de la población. El aumento de la productividad de los cultivos conferido por los tipos de plantas creados durante el periodo de la revolución verde apoyó el auge demográfico que siguió a las dos guerras mundiales. Desde entonces, a pesar del uso de variedades mejoradas y de tecnologías avanzadas, el potencial de rendimiento de los cultivares de arroz actuales ha mejorado sólo un poco, lo que indica que estas variedades han alcanzado un techo de rendimiento (Akita 1994). Recientemente se está intentando aumentar el potencial de rendimiento del arroz mediante la ingeniería de una fotosíntesis eficiente de tipo C4 en el arroz (Kajala et al. 2011). Para ello, hay que insertar en el arroz un conjunto de genes que regulen la anatomía de la hoja y los procesos bioquímicos y expresarlos de forma adecuada, lo que actualmente no es posible únicamente mediante las técnicas convencionales de fitomejoramiento. Por lo tanto, la ingeniería genética para mejorar la vía fotosintética del arroz proporcionaría una oportunidad suficiente para mejorar la productividad real del grano, así como el potencial de rendimiento. La ingeniería genética proporciona una herramienta de mejora eficiente y precisa en la que sólo se pueden introducir los genes de interés, incluso a partir de especies emparentadas de forma lejana.

En las plantas C3 como el arroz, el CO2 es asimilado en un compuesto de 3 carbonos por la enzima fotosintética ribulosa-1, 5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (Rubisco). Como su nombre indica, la Rubisco también cataliza la oxidación de la ribulosa-1, 5-bisfosfato (RuBP) en un proceso de despilfarro conocido como fotorrespiración que puede suponer una pérdida de hasta el 25% del carbono previamente fijado (Sage 2004). A temperaturas superiores a los 30°C, típicas de las zonas tropicales de cultivo de arroz en el mundo, la tasa de oxigenación aumenta sustancialmente y esto reduce considerablemente la eficiencia fotosintética de las plantas C3 hasta en un 40% (Ehleringer y Monson 1993). Así, la fotosíntesis del arroz en los trópicos y las regiones templadas cálidas se vuelve ineficiente. Las plantas C4, que tienen un mecanismo de concentración de CO2 en sus hojas, tienen niveles muy reducidos de fotorrespiración y, por lo tanto, han evolucionado para prosperar en entornos cálidos y áridos y ofrecen valiosas perspectivas para las estrategias de mejora de los cultivos. El arroz con un mecanismo de fotosíntesis C4 tendría una mayor eficiencia fotosintética a la vez que utilizaría más eficazmente recursos escasos como la tierra, el agua y los fertilizantes, concretamente el nitrógeno (Hibberd et al. 2008). Dado que tendrá un buen rendimiento en condiciones de alta temperatura y requerirá menos agua y nitrógeno, el arroz C4 conferirá beneficios a diferentes tipos de ecosistemas arroceros, incluidas las tierras marginales.

La fotosíntesis de tipo C4 es uno de los tres tipos de mecanismos bioquímicos adoptados por las plantas para fijar el CO2 atmosférico, siendo los otros las vías C3 y del metabolismo ácido crasuláceo (CAM). La fotosíntesis C4 ha evolucionado más de 66 veces de forma independiente (Sage et al. 2012) al menos en 19 familias durante la evolución de las angiospermas a partir de sus ancestros C3 (Muhaidat et al. 2007) y conlleva alternancias en las estructuras celulares, la bioquímica y, por tanto, el desarrollo de las hojas. Esta forma altamente especializada de fotosíntesis ha desarrollado esencialmente un mecanismo de concentración de CO2 alrededor de la enzima Rubisco, eliminando así la función de oxigenasa de la Rubisco y reduciendo el desperdicio de energía debido a la fotorrespiración (Douce y Heldt 2000). La Rubisco de las especies C4 es más eficiente que la de las especies C3 en términos de carboxilación (Kubien et al. 2008). Los otros beneficios asociados al sistema C4 incluyen una mayor eficiencia en el uso del agua porque se puede mantener un gradiente de concentración más pronunciado para la difusión de CO2 a través de estomas parcialmente cerrados, una mayor eficiencia en el uso de la radiación ya que la eficiencia de la fotosíntesis C4 no se satura con una alta intensidad de luz (Rizal et al. 2012) y una mayor eficiencia en el uso del nitrógeno porque requerirá menos Rubisco y, por lo tanto, menos nitrógeno.

Las plantas C4 son potencialmente más productivas a temperaturas más altas que las que suele experimentar el arroz. Para aprovechar este sistema fotosintético más eficiente en un momento en que la población y los precios de los alimentos se están disparando, se está intentando insertar en el arroz el mecanismo C4, como el que se encuentra en el maíz (Rizal et al. 2012). Este novedoso enfoque para modificar el sistema de fotosíntesis del arroz es un esfuerzo difícil y a largo plazo porque la vía C4 es muy compleja y todavía se desconocen muchos factores que controlan el mecanismo. Por lo tanto, se requiere el ingenio y la experiencia de los científicos involucrados en diversas disciplinas como la ingeniería genética, la bioquímica, la bioinformática, la biología molecular, la fotosíntesis, la biología de sistemas, la fisiología, el mejoramiento de plantas, la metabolómica, etc. Para ello, se conceptualizó y estableció el consorcio de arroz C4 que comenzó el trabajo práctico de ingeniería de arroz C4 desde 2009 (http://photosynthome.irri.org/C4rice/). Esta revisión proporciona una actualización sobre los requisitos para desarrollar el arroz C4 y los avances realizados en el campo de la ingeniería genética. Basándose en el estudio de la evolución del C4 a partir de las especies C3 y los cambios asociados, las siguientes modificaciones son esenciales para establecer una vía fotosintética C4 funcional en el arroz.

Aumentar el número y el tamaño de los cloroplastos en las células de la vaina del haz del arroz

En el arroz más del 90% del total de cloroplastos se localizan en las células del mesófilo (MCs) dentro de la hoja (Yoshimura et al. 2004); mientras que, en las plantas C4 tanto las MCs como las células de la vaina del haz (BSCs) poseen igual número de cloroplastos (Figura 1A y B). Esto se debe a que en las plantas C3, todo el proceso de fotosíntesis tiene lugar en las MC, pero en las plantas C4 el proceso de fotosíntesis está compartimentado en las MC y las BSC. Las MCs realizan la primera fijación de CO2 en la que se forma un compuesto de 4 carbonos llamado oxaloacetato y éste se convierte en ácidos C4 como el malato que son transportados a las BSCs permitiendo así la asimilación eficiente de CO2 en carbohidratos por el ciclo de Calvin en las BSCs. Por lo tanto, a diferencia de las plantas C3, las BSC de las plantas C4 tienen funciones fotosintéticas como la descarboxilación del compuesto C4 y el proceso del ciclo de Calvin. Para llevar a cabo estos procesos, los BSC de las plantas C4 son más grandes y tienen más cloroplastos, lo que hace que los BSC sean más pronunciados y fotosintéticamente activos. Los BSCs en las especies C3 funcionan para equilibrar la presión hidráulica, evitar la entrada de aire desde los espacios intercelulares al xilema, proporcionar un depósito de agua para amortiguar las pérdidas debidas a la transpiración, permitir la entrada y la dispersión de la mayor intensidad de luz que incide en las venas hacia la hoja (Nikolopoulos et al. 2002). Otras funciones de las BSCs de las plantas C3 incluyen el transporte de nitrógeno, azufre, carbohidratos y el papel en la vía de señalización que ha sido ampliamente revisado en (Leegood 2008). En las especies C4, las BSCs y las MCs cooperan en una versión de dos pasos de la fotosíntesis. Como resultado, para asegurar un contacto directo entre las BSCs y las MCs, las plantas C4 poseen un tipo especial de anatomía foliar acompañada de la proliferación de cloroplastos en las BSCs. Para introducir la vía C4 en el arroz, se necesitan más cloroplastos fotosintéticos en los BSC de los que tiene ahora el arroz. Esto podría hacerse sobreexpresando los elementos genéticos necesarios para el desarrollo de los cloroplastos, como los genes tipo Golden2 (GLK), de forma específica para cada célula, utilizando promotores de genes C4 como la fosfoenol piruvato carboxilasa (PEPC) de Zea mays para la expresión específica de los MC y el promotor de la fosfoenol piruvato carboxiquinasa (PCK) de Zoysia japonica para la expresión específica de los BSC en las hojas de arroz (Matsuoka et al. 1994; Nomura et al. 2005).

Los miembros de la familia del gen Golden2-like (GLK) codifican factores de transcripción nuclear que han sido implicados en la regulación del desarrollo de los cloroplastos en Arabidopsis, Zea mays y el musgo Physcomitrella patens (Rossini et al. 2001). En cada una de estas especies, los genes GLK existen como un par homólogo denominado GLK1 y GLK2 (Waters et al. 2009). En musgo y Arabidopsis los genes GLK son redundantes y funcionalmente equivalentes, mientras que en maíz y sorgo los genes GLK actúan de forma específica para cada tipo de célula para dirigir el desarrollo de cloroplastos dimórficos (Waters et al. 2008; Wang et al. 2013a). En el maíz, los transcritos de Golden2 (G2) y su homólogo ZmGLK1 se acumulan principalmente en las células BS y M, respectivamente, lo que sugiere un papel específico para cada gen que regula la diferenciación dimórfica de los cloroplastos (Wang et al. 2013a).

Reducir el espaciado de las venas aumentando así la densidad de las mismas en la hoja

En las especies C3, la fotosíntesis tiene lugar en las MCs. Un número elevado de MCs entre las venas consecutivas (Figura 1A) aleja las venas entre sí aumentando así el espaciamiento de las venas o reduciendo la densidad de las mismas. En las hojas de arroz hay menos de 6 venas por mm (Figura 2A), la Setaria viridis y el sorgo (ambas son especies C4 típicas) tienen más de 7 venas por mm (Figura 2B y C). Las hojas de las especies C4 tienen una media de 2 MCs entre las venas (Figura 1B). La mayor densidad de venas en las hojas de las plantas C4 conduce a una relación casi uno a uno de los volúmenes de los tejidos M y BS. La anatomía interna de una hoja C4 suele estar compuesta por un patrón repetitivo de vena-BS-M-M-BS-vena. Las BSCs rodeadas de MCs forman una estructura en forma de corona; este tipo de anatomía de la hoja fue denominada como «anatomía Kranz» por el botánico alemán G. Haberlandt. Las BSCs C4 tienen un citoplasma denso y están llenas de un gran número de cloroplastos (Figura 1B). Para el funcionamiento eficiente de la vía C4, es indispensable un estrecho contacto entre las células M y BS y éstas están estrechamente interconectadas entre sí con un gran número de plasmodesmos Dengler y (Nelson 1999). La anatomía de Kranz se encuentra con poca variación en casi todos los linajes de monocotiledóneas y dicotiledóneas que utilizan el modo de dos células de la vía fotosintética C4. Los estudios sobre la anatomía y morfología de las hojas han revelado varios genes responsables del crecimiento, desarrollo o deformación de las células en las hojas. Un gen ACAULIS1 era responsable del alargamiento de las células de la hoja (Tsukaya et al. 1993). La mutación en el gen CURLEY LEAF (CLF) produjo hojas rizadas en Arabidopsis (Kim et al. 1998). El aumento de la terminación de las venas libres, el patrón de venación abierta y la estructura redondeada de las hojas fueron causados por rotunda 1 (RON1) (Robles et al. 2010). La mutación en el gen Scarecrow en el maíz mostró un aumento en el número de BSCs, una diferenciación inusual del cloroplasto BS, una disminución de las venas menores y una alteración en la densidad de las venas (Slewinski et al. 2012). Estos estudios relacionados con el patrón anormal de las venas causado por la mutación de determinados genes proporcionan alguna pista sobre cómo se regula la anatomía de Kranz y sugieren la participación de múltiples vías en el desarrollo del patrón de Kranz. Se ha determinado que la red reguladora SCARECROW/SHORTROOT es uno de los componentes importantes necesarios para el patrón de la anatomía de Kranz porque las hojas de las plantas C3 con el gen Scarecrow mutado eran normales, mientras que en las plantas C4 la mutación en el mismo gen dañaba la anatomía de Kranz (Slewinski et al. 2012; Wang et al. 2013b). Recientemente, se ha demostrado que la introducción de cromosomas de maíz en la avena podría aumentar el tamaño del BSC y reducir el espaciado de las venas en las hojas de avena C3 demostrando que la anatomía de la hoja C3 puede ser modificada (Tolley et al. 2012). Además, se ha realizado un gran esfuerzo para cribar mutantes de sorgo (C4) con un mayor espaciamiento de las venas y mutantes de arroz (C3) con un espaciamiento reducido de las venas para poder identificar los genes que controlan el rasgo de espaciamiento de las venas (Rizal et al. 2012).

La actividad del ciclo de Calvin debe reducirse significativamente en el MC y aumentar enormemente en el BSC del arroz

La fotosíntesis del C4 se caracteriza por un mecanismo bioquímico de bombeo de CO2 que eleva la concentración de CO2 en el sitio de Rubisco. Un alto nivel de CO2 alrededor de la Rubisco reduce la tasa de fotorrespiración y aumenta la asimilación neta de CO2, lo que conduce a una fotosíntesis altamente eficiente Weber y von (Caemmerer 2010). Para lograr esto, la asimilación de CO2 en C4 se distribuye en dos tipos de células, las MC y las BSC (Figura 3). Por lo tanto, la fijación de carbono en C4 depende de la expresión y localización de genes específicos de la célula. Las células vecinas fotosintéticamente activas BS y M interactúan para eliminar la fijación de O2 catalizada por Rubisco. En las plantas C4 de tipo bicelular, el CO2 se fija primero en el ácido C4 denominado oxaloacetato en las MC por una carboxilasa insensible al O2 llamada fosfoenol piruvato carboxilasa (PEPC, EC 4.1.1.31). El oxaloacetato se convierte entonces en malato o aspartato y es transportado a las BSCs donde se descarboxila y se libera el CO2. Este CO2 es re-fijado por la Rubisco y todas las actividades subsiguientes del ciclo Calvin tienen lugar en el cloroplasto de las BSCs (Nelson y Langdale 1989). En consecuencia, para que el arroz sea C4, la actividad de la Rubisco tiene que reducirse en gran medida en los MCs y aumentarse en los BSCs, lo cual confina el ciclo Calvin a los BSCs del arroz, como en un sistema C4. Por otro lado, ciertos genes que codifican las enzimas C4 como la β anhidrasa carbónica (CA) y el PEPC tienen que estar sobreexpresados en el citosol de las MC del arroz para facilitar la fijación primaria de CO2 de manera que el CO2 pueda ser concentrado y suministrado a la Rubisco en las BSC. El ciclo C4 también implica un amplio transporte de metabolitos a través de la membrana de la envoltura del cloroplasto y el plasmalema de las MC y BSC (Figura 3). Así, además de las enzimas centrales del C4, es decir, la CA, la PEPC, la piruvato ortofosfato (Pi) diquinasa (PPDK, EC 2.7.9.1), la malato deshidrogenasa dependiente de NADP (NADP-MDH, EC 1.1.1.82) y la enzima málica dependiente de NADP (NADP-ME, EC 1.1.1.40), la vía C4 también requiere la inserción de transportadores de metabolitos para el oxaloacetato, el malato, la triosa-fosfato y el piruvato en el arroz para proporcionar una mayor capacidad de transporte para los intermedios del ciclo C4 de manera que el ciclo de Calvin pueda funcionar eficazmente en las BSC (Weber y von Caemmerer 2010).

La fotorrespiración en las células del mesófilo tiene que ser muy reducida

En las plantas C3 la fijación del carbono y el ciclo de Calvin tienen lugar en las CM. Durante la fijación del carbono, la ribulosa-1,5-bisfosfato (RuBP) – un compuesto de cinco carbonos, catalizado por una enzima ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (Rubisco, EC.4.1.1.39) reacciona con el CO2 para formar dos moléculas de un compuesto de 3 carbonos llamado 3-fosfoglicerato (3-PGA). Dentro del ciclo de Calvin, las dos moléculas de PGA forman una molécula de azúcar rica en energía (fosfato de triosa) y regeneran RuBP para el siguiente ciclo. En las concentraciones atmosféricas actuales de CO2 (aproximadamente 400 ppm), la Rubisco también cataliza una reacción entre el RuBP y el O2 que da lugar a una molécula de 2-fosfoglicolato y otra de 3-PGA (Peterhansel y Maurino 2011). El 2-fosfoglicolato tiene que volver a convertirse en 3-PGA a través del proceso llamado fotorrespiración, que implica una serie de reacciones bioquímicas. Durante este proceso se produce una pérdida de carbono y nitrógeno previamente fijados y también se debe utilizar energía extra (Sharpe y Offermann 2013).

Las plantas C4 han desarrollado mecanismos para restringir la localización y las actividades de Rubisco en las MC. Las MCs impiden espacialmente el contacto entre la Rubisco en las BSCs y el O2 en los espacios intercelulares, evitando así la pérdida de energía a través de la fotorrespiración. La eliminación de la fotorrespiración por parte de las plantas C4 se pone de manifiesto por su bajísimo punto de compensación de CO2, que es casi nulo, y una eficiencia de carboxilación (CE) constantemente alta, sin responder a los cambios en las concentraciones de O2 (Figura 4). Por el contrario, en las plantas C3, con el cambio de la concentración de O2 del 21% al 2%, el punto de compensación disminuyó significativamente de 55 a 30 ppm (Tabla 1). En la Figura 4, se calculó el CE de acuerdo con (Li et al. 2009) que mostró que el CE del sorgo no cambió significativamente con el cambio en el nivel de O2, pero en el arroz hubo una mejora altamente significativa en el CE cuando el nivel de O2 se redujo del 21 al 2% (Figura 4 y Tabla 1). El aumento del CE en el sorgo fue sólo del 6,1%, mientras que el del arroz fue del 41,5% con la disminución de la concentración de O2 intercelular al 2% (Tabla 1). Estos datos muestran que existe un gran potencial para aumentar la capacidad fotosintética del arroz mediante la disminución de la fotorrespiración, lo que a su vez aumentaría sustancialmente el rendimiento. Una forma de reducir la fotorrespiración en el MC es reduciendo la proteína glicina descarboxilasa (GDC) en el MC y restringiendo su acumulación en el BSC para que la descarboxilación de la glicina ocurra exclusivamente en el BSC, generando así una mayor concentración de CO2 en el BSC, similar a la de los intermedios C3-C4 (Monson y Rawsthorne 2000). El consorcio de arroz C4 está probando este enfoque mediante el uso de un microARN artificial diseñado contra la subunidad GDC-H del arroz que es impulsado por el promotor ZmPEPC (Kajala et al. 2011). Este mecanismo bioquímico requiere la especialización celular de las BSC, que incluye un aumento del número de cloroplastos y mitocondrias que enriquecen el contenido de los orgánulos de las BSC de arroz para ayudar a recapturar el CO2 liberado por la descarboxilación de la glicina por la GDC (Ueno 2011). Otro enfoque que tuvo éxito para capturar el CO2 liberado por la fotorrespiración al sitio de la fotosíntesis es mediante la transferencia de la vía catabólica del glicolato de Escherichia coli a los cloroplastos de Arabidopsis thaliana en la que el glicolato en el cloroplasto se convirtió directamente en glicerato (Kebeish et al. 2007). Esta estrategia que redujo la fotorrespiración y mejoró la fotosíntesis en Arabidopsis implicó la transformación nuclear por etapas con cinco genes bacterianos dirigidos al cloroplasto que codifican la glicolato deshidrogenasa, la glioxilato carboligasa y la semialdehído reductasa tartrónica podría aplicarse a otras plantas C3 como el arroz, sin embargo, el uso de genes bacterianos puede no ser preferible en la ingeniería del arroz C4.

Ingeniería de la vía C4 en el arroz

Se pensó que el sistema C4 unicelular podría ser más rápido de instalar en las plantas C3. Hay intentos de diseñar el sistema de fotosíntesis C4 unicelular en el arroz también (Miyao et al. 2011). Para introducir la vía unicelular tipo C4 en la que el MC se hace para capturar y liberar CO2 de la manera que tiene lugar en Hydrilla verticillata (L.f) Royle., cuatro enzimas (PEPC, PPDK, NADP-MDH, y NADP-ME) involucradas en la vía fueron sobreproducidas en las hojas de arroz transgénico (Ku et al. 1999; Fukayama et al. 2001; Tsuchida et al. 2001; Taniguchi et al. 2008). Algunos de los principales problemas encontrados que deben ser abordados para hacer una vía unicelular similar a la C4 en el arroz son: el mecanismo para facilitar la actividad de transporte de PEP a través de la envoltura del cloroplasto, la importación de OAA en los cloroplastos y la dirección de la reacción NADP-ME, la participación de NADP-MDH, la presencia de PEPC endógena dentro del cloroplasto MC del arroz y la elevación adicional de la actividad de NADP-MDH fueron reportados como necesarios (Miyao et al. 2011). Las especies C4 unicelulares terrestres como Bienertia cycloptera, B. sinuspersici y Suaeda aralocaspica, pertenecientes a la familia Chenopodiaceae también necesitan una compartimentación espacial de la asimilación y descarboxilación del carbono (Chuong et al. 2006). Estas especies tienen cloroplastos dimórficos en esos compartimentos. Los intentos anteriores produjeron un ciclo inútil que se debió a que no hubo cambios en la anatomía, a la falta de transportadores apropiados y a que los genes del maíz transformados en el arroz no se expresaron apropiadamente de manera específica para la célula y no fueron regulados como en el maíz, sino que fueron regulados como las isoformas C3 endógenas del arroz (Miyao et al. 2011).

Para diseñar la vía fotosintética de C3 a C4 en dos décadas, lo que tomó millones de años en la naturaleza, el consorcio de arroz C4 comenzó el descubrimiento simultáneo de genes y la ingeniería de genes ya conocidos en el arroz con el objetivo de formar arroz C4 con anatomía tipo Kranz. Genes C4 como CA, PEPC, PPDK, NADP-ME y NADP-MDH se clonaron del maíz y se transformaron en arroz. También los transportadores que se expresaron en exceso en las vías metabólicas C4, como el transportador de 2-oxoglutarato/malato (OMT1), el transportador de dicarboxilato1 (DiT1), el transportador de dicarboxilato2 (DiT2), el transportador de PEP/fosfato (PPT1), la proteína de la envoltura del mesófilo (MEP) y el translocador de fosfato de triosa (TPT), que se identificaron recientemente a través de la proteómica de las células BS y MS del maíz (Friso et al. 2010) se están transformando en arroz (Figura 3). Los miembros del consorcio del arroz C4 también participan en el descubrimiento de nuevos genes relacionados con la anatomía de Kranz (Wang et al. 2013b). Una vez probados, los prometedores genes candidatos que controlan la anatomía de Kranz también se introducirán en las plantas de arroz que han sido diseñadas con los genes de la vía bioquímica C4.