Free Press

By G.P. ThomasApr 15 2013

Image Credits: khawfangenvi16/.com

Korkeasuorituskykyinen nestekromatografia tai korkeapainen nestekromatografia (High Pressure Liquid Chromatography, HPLC) on kromatografinen menetelmä, jota käytetään yhdisteiden seoksen erottamiseen analyyttisessä kemiassa ja biokemiassa seoksen yksittäisten komponenttien tunnistamiseksi, kvantifioimiseksi tai puhdistamiseksi.

Käänteisfaasinen HPLC:n tai ultrakorkeasuorituskykyinen nestekromatografia (Ultra-High-Performance Liquid Chromatography, UHPLC) on yleisimmin käytössä oleva erotustapa. Se tarjoaa dynaamisen retention yhdisteille, joilla on hydrofobinen ja orgaaninen toiminnallisuus. Hydrofobisten ja van der Waals -tyyppisten vuorovaikutusten yhdistelmä kaikkien kohdeyhdisteiden ja sekä paikallaan pysyvän että liikkuvan faasin välillä mahdollistaa näiden yhdisteiden pidättämisen käänteisfaasilla.

Miten HPLC toimii?

Hyvin pieninä määrinä erotettava ja tutkittava näyteseos lähetetään pylvään läpi kulkeutuvaan liikkuvan faasin virtaukseen. Saatavilla on erityyppisiä kolonneja, joiden sorbentit ovat erikokoisia ja -pintaisia.

Seos liikkuu kolonnin läpi vaihtelevalla nopeudella ja on vuorovaikutuksessa sorbentin kanssa, jota kutsutaan myös stationäärifaasiksi. Seoksen kunkin komponentin nopeus riippuu 1) sen kemiallisesta luonteesta, 2) kolonnin luonteesta ja 3) liikkuvan faasin koostumuksesta. Aikaa, jolloin tietty analyytti poistuu kolonnista, kutsutaan sen retentioajaksi. Retentioaika mitataan tietyissä olosuhteissa ja sitä pidetään tietyn analyytin yksilöivänä ominaisuutena.

Sorbenttipartikkelit voivat olla luonteeltaan hydrofobisia tai polaarisia. Yleisesti käytettyjä liikkuvia faaseja ovat veden ja orgaanisten liuottimien, kuten asetonitriilin ja metanolin, sekoittuvat yhdistelmät. Myös vedettömiä liikkuvia faaseja voidaan käyttää.

Liikkuvan faasin vesikomponentti voi sisältää happoja, kuten muurahaishappoa, fosforihappoa tai trifluorietikkahappoa, tai suoloja näytekomponenttien erottamisen mahdollistamiseksi. Liikkuvan faasin koostumus joko pidetään vakiona tai sitä vaihdellaan kromatografisen analyysin aikana. Vakiomuotoinen lähestymistapa on tehokas sellaisten näytekomponenttien erottamisessa, joiden affiniteetti stationäärifaasia kohtaan ei ole kovin erilainen. Vaihtelevassa lähestymistavassa liikkuvan faasin koostumus vaihtelee alhaisesta korkeaan eluointivahvuuteen. Liikkuvan faasin eluointivahvuus heijastuu analyytin retentioaikoihin, joissa korkea eluointivahvuus tuottaa nopean eluoitumisen.

Liikkuvan faasin koostumus valitaan useiden näytekomponenttien ja stationaarifaasin välisten vuorovaikutusten voimakkuuden perusteella.

HPLC-partitiointimenetelmä on melko samankaltainen kuin neste-neste-uutto, paitsi että edellinen on jatkuva prosessi, toisin kuin jälkimmäinen, joka on vaiheittainen prosessi. On suositeltavaa suorittaa koepartitiointimenetelmiä, jotta voidaan määrittää tarkka HPLC-menetelmä, jolla saadaan aikaan riittävä erottelu.

HPLC-järjestelmien valmistajat

Markkinoilla on nykyään laaja valikoima HPLC-vaihtoehtoja. Seuraavassa on luettelo eri HPLC-järjestelmien valmistajista ja lyhyt esittely heidän tuotteistaan:

• Dionex, joka perustuu kromatografian tieteeseen, valmistaa UltiMate® 3000 Rapid Separation LC -järjestelmää, UltiMate 3000 RSLCnano -järjestelmää ja Corona®-perheen universaalia ladattujen aerosolidetektorien tuoteperhettä.
• Jasco Analytical Instruments tarjoaa erilaisia HPLC-järjestelmiä. LC-2000 Plus -sarjan HPLC-järjestelmät ovat ainutlaatuisesti konfiguroitavissa. Korkean suorituskyvyn ja edullisten kustannusten ansiosta nämä HPLC-järjestelmät voidaan mukauttaa lähes kaikkiin vaatimuksiin yksinkertaisesta isokraattisesta QA:sta edistyneeseen moniliuotin/monikolonnimenetelmien kehittämiseen. Isokraattinen LC-2000plus-Iso on varustettu pumpulla, kaasunpoistajalla, automaattisella näytteenottimella ja UV/Vis-detektorilla. Pumppu on suunniteltu virtausnopeuksille 1µL – 10mL/min jopa 500 baarin paineella käytettäväksi 2, 3, 4, 6 ja jopa 10mm ID-kolonnien kanssa. Binary Gradient LC-2000plus-HPG on samanlainen kuin isokraattinen järjestelmä, mutta siinä on kahden liuottimen gradienttipumppukokoonpano. Pumpun virtausnopeudet ovat yhteensopivia 1 mm:n kolonnien kanssa. Kvaternäärinen gradientti LC-2000plus-LPG on myös samanlainen kuin isokraattinen järjestelmä; tässä mallissa on kuitenkin kvaternäärinen gradienttipumppukonfiguraatio maksimaalisen liuotinjoustavuuden varmistamiseksi.
• Gilsonin Preparative HPLC System -järjestelmässä on laaja virtausalue, joka voidaan sovittaa sekä semipreparatiivisiin että preparatiivisiin erotteluihin. Sen suuri pumppausteho mahdollistaa laajan valikoiman preparatiivisia kolonnikokoja. Järjestelmä on suunniteltu uudella huuhteluasemajärjestelmällä, joka käsittää virtaussuihkupesun ja mahdollistaa jopa kahden eri huuhteluliuottimen käytön.
• AAPPTecin Sharp™ HPLC Systems -järjestelmissä on mikroprosessoriohjatut pumput, jotka mahdollistavat erittäin tarkat ja erittäin täsmälliset virtausnopeudet, mikä auttaa saavuttamaan erinomaisen analyyttisen toistettavuuden ja korkeimman mittaustarkkuuden.

Muut valmistajat nykyisillä markkinoilla ovat Agilent, Beckman Coulter, Bio-Rad ja Buck Scientific.

HPLC:n edut

HPLC-järjestelmien tärkeimmät edut ovat seuraavat:

• Hallitsee ja automatisoi kromatografiavälineistöä
• Tarjoaa tiedonhallinnan, tietoturvaominaisuudet sekä raportoinnin ja välinevalidoinnin.
• Tehokas ja mukautuva
• Lisää tuottavuutta hallitsemalla kaikkia analyysin osa-alueita – näytteestä laitteeseen ja erottelusta tulosten raportointiin.
• Hinnaltaan edullinen

HPLC:n sovellukset

HPLC-tekniikan päätarkoitus on tietyn analyytin tai yhdisteen tunnistaminen, kvantifiointi ja puhdistaminen. Sekä kvantitatiivinen että kvalitatiivinen analyysi voidaan tehdä. HPLC:tä voidaan käyttää seuraavissa sovelluksissa:

• Veden puhdistus
• Epäpuhtauksien havaitseminen lääketeollisuudessa
• Jälkikomponenttien esikonsentrointi
• Ligandinvaihtokromatografia
• Proteiinien ioninvaihtokromatografia
• Korkean pH:n anionin—hiilihydraattien ja oligosakkaridien vaihtokromatografia

Lähteet ja lisätietoa

• Reversed Phase HPLC/UHPLC Chromatography-Phenomenex
• Dionex Products-Dionex
• HPLC Systems-aapptec
• Preparative HPLC System-Gilson

Tämä artikkeli on päivitetty 22. huhtikuuta, 2019.

Kirjoittanut

G.P. Thomas

Gary valmistui Manchesterin yliopistosta ensimmäisen luokan arvosanalla geokemiasta ja maisteriksi geotieteistä. Työskenneltyään Australian kaivosteollisuudessa Gary päätti ripustaa geologin saappaat jalkaansa ja ryhtyä kirjoittamaan. Kun hän ei ole kehittämässä ajankohtaista ja informatiivista sisältöä, Garyn löytää yleensä soittamasta rakasta kitaraansa tai katsomasta, kun Aston Villa FC nappaa tappion voiton leuasta.

Sitaatit

.