Abstract
Tässä artikkelissa tutkitaan tiheysfunktionaaliteorialla useiden valittujen tyypillisten substraattien, kuten aryyliamiinien ja aryylihydratsiinien, asetylaatiomekanismeja kokeista. Tulokset osoittavat, että kaikille siirtymätiloille on ominaista nelijäseninen rengasrakenne, ja hydralatsiini (HDZ) on voimakkain substraatti. Kaikkien yhdisteiden bioaktiivisuus lisääntyy järjestyksessä PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ. Konjunktiovaikutus ja N-atomin yksinäisten parien delokalisaatio ovat avainasemassa reaktiossa. Kaikki tulokset ovat yhdenmukaisia kokeellisten tietojen kanssa.
1. Johdanto
Aryyliamiinin N-asetyylitransferaasit (NAT, EC 2.3.1.5) ovat vaiheen II aineenvaihdunnan entsyymejä, joita esiintyy sekä prokaryooteissa että eukaryooteissa . N-asetylaatioreaktio johtaa aryyliamiiniksenobioottien detoksifikaatioon ja johtaa lopulta elektrofiilisiin aryylinitreniumioneihin, joiden katsotaan olevan vastuussa DNA-adduktien muodostumisesta . Ihmisiin nähden kahdella toimivalla NAT-isoentsyymillä, NAT1:llä ja NAT2:lla, on suuria eroja substraattispesifisyydessä ja kudosjakautumisessa huolimatta 81 prosentin aminohapposekvenssi-identiteetistä . Jälkimmäinen, NAT2, ilmentyy pääasiassa maksassa ja suoliston epiteelissä . Aiemmissa tutkimuksissa on oletettu, että NAT:t katalysoivat asetyylinsiirtoa klassisella ping-pong-kineettisellä mekanismilla (kaavio 1). Ihmisen NAT2:n ja Salmonella typhimurium NAT:n (StNAT) kohdekohtainen mutageneesianalyysi viittasi siihen, että aktiivisen alueen kysteiinijäännös on vastuussa asetylaatioprosessin välittämisestä. Äskettäin tehdyt presteady-state- ja steady-state-kineettiset tutkimukset p-nitrofenyyliasetaatilla (PNPA) ja NAT2:lla paljastivat, että NAT2:n katalyyttinen mekanismi saattaa riippua tiolaatti-imidatsoliumparin muodostumisesta. Vaikka entsyymiä esiintyy sekä eukaryooteissa että prokaryooteissa, NAT:ien endogeeniset tehtävät ovat edelleen epäselvät. Substraatin määritys osoitti, että NAT:t voivat asetyloida sekä aryyliamiineja että aryylihydratsiineja . Asetyylinsiirtoreaktiossa tarvittavat vaiheet koostuvat asetyyliryhmän siirrosta aktiivisen alueen kysteiinijäämästä substraattiin ja yhden protonin poistamisesta jälkimmäisestä edelliseen. Tässä työssä on saatavilla yksityiskohtainen teoreettinen tutkimus aryyliamiinien ja aryylihydratsiinisubstraattien käyttäytymisestä asetylaatiossa, mukaan lukien niiden rakenteiden ominaisuudet, siirtymätilat ja energioiden profiilit.
2. Menetelmät
Kaikki laskelmat suoritettiin tiheysfunktionaaliteorian (DFT) B3LYP-menetelmällä, joka on toteutettu Gaussian03-ohjelmapaketissa , jota on aiemmin käytetty menestyksekkäästi useisiin entsymaattisiin järjestelmiin. Kun käytettiin 6-31G*- ja 6-311+G (3df, 2p)-perusjoukkoja, B3LYP-hybridifunktionaalia pidettiin parempana kuin Hartree-Fock- (HF) ja MP2-menetelmiä . Vaikka B3LYP-menetelmä on joskus epäonnistunut dispersiopitoisten vuorovaikutusten käsittelyssä, sitä on sovellettu menestyksekkäästi moniin biologisiin järjestelmiin .
Kaikkien reaktanttien, välituotteiden ja tuotteiden geometriat optimoidaan B3LYP/6-31G*-teoriatasolla. Vakaimmat konformaatiot sekä niiden energiat jokaisessa tasapaino- ja siirtymätilassa on selvitetty. Taajuuslaskelmat on suoritettu kaikille tuloksena saaduille stationaarisille pisteille, ja jokaisella siirtymätilalla on vain yksi imaginaarinen taajuus. Lisäksi MP2/6-311+G**-menetelmää käytetään optimoitujen rakenteiden stationaaristen pisteiden optimointiin tarkempien energiaprofiilien saamiseksi. Jos sitä ei erikseen mainita, kaikki seuraavat energia-analyysit viittaavat MP2/6-311+G**//B3LYP/6-31G (d)-laskelmien tuloksiin.
3. Tulokset ja keskustelu
3.1. Tulokset ja pohdinta. Substraattien rajaobitaalit
Kuusi substraattia, p-aminobentsoehappo(PABA), 4-metoksilaniliini(4-MA), 4-aminosalisylaatti (4-AS), 5-aminosalisylaatti(5-AS), isoniatsidi(INZ), hydralatsiini (HDZ), on valittu viitteiden mukaisesti , jotka voidaan jakaa kahteen erilliseen perheeseen: aryyliamiineihin ja aryylihydratsiiniin. Taulukossa 1 on lueteltu kaikkien kuuden substraatin rajaobitaalien energiat (mukaan lukien HOMO-2, HOMO-1, HOMO, LUMO, LUMO+1 ja LUMO+2), joilla katsotaan olevan tärkeä rooli bioentsymaattisissa järjestelmissä . Aryyliamiinien HOMO-energiat pienenevät järjestyksessä 4-MA > 5-AS > PABA > 4-AS, mikä osoittaa niiden nukleofiilisen reaktiivisuuden lisääntymistä. Kaikista kuudesta substraatista (ks. kuva 1 lisämateriaaleissa, jotka ovat saatavilla verkossa osoitteessa doi: 10.1155/2009/783035) INZ:llä on suurin energia-aukko HOMO:n ja LUMO:n välillä, mikä viittaa sen vakauteen. Luonnollisen populaatioanalyysin (NPA) tulokset osoittivat, että aryyliamiiniperheen aktiiviset amino-N-atomit ovat elektronegatiivisempia kuin hydratsiiniryhmän atomit, mikä johtuu pääasiassa konjugaatiovaikutuksesta.
Vaikka PABA:lla ja 4-AS:lla on erilaisia substituutioita aminoryhmän p-kohdassa kuusirenkaassa, niiden bioaktiivisuus on lähes sama. Molekyylien välinen H-sidos stabiloi itse substraatin, jonka energian pudotus on noin 19-21 kJ/mol. Sekä 5-AS:n HOMO- että LOMO-energiat ovat korkeammat kuin 4-A𝑆s:n, mikä viittaa siihen, että edellinen on reaktiivisempi kuin jälkimmäinen.
Aryylihydratsiinisubstraattien osalta N-atomien yksinäinen pari kuusirenkaan selkärangassa delokalisoituu koko systeemissä, jotta sen stabiilisuus paranee. HDZ:n 𝐸(𝐿-𝐻)-arvot ovat 0,0318 a.u. suuremmat kuin INZ:n, mikä osoittaa sen jälkimmäistä suurempaa reaktiivisuutta.
3.2. JOHTOPÄÄTÖKSET. Erilaiset reitit ja siirtymätilat
Periaatteessa kaikki substraatit voivat reagoida aktiivisen keskuksen kysteiinijäännöksen kanssa koordinoitua reittiä tai vaiheittain. Edellisessä tapauksessa siirtymätiloissa (ks. kuvat 1 ja 2, con-ts) tapahtuu koordinoitu vedyn H5 siirtyminen kysteiinin S1-atomiin ja sidoksen muodostuminen N4- ja C2-atomien välille. Vanhojen sidosten (N4H5 ja S1C2) katkeaminen ja uusien (C2N4 ja S1H5) muodostuminen tapahtuu samanaikaisesti. Reaktantteja ja kohdetuotteita yhdistää ainoa siirtymätila potentiaalienergiapinnalla (PES). Kaikkien siirtymätilojen tärkeimmät rakennetiedot on lueteltu oheismateriaalien taulukossa 1. Vaiheittaisessa mekanismissa H5-atomi siirtyy ensin karbonyyliryhmän O3-atomiin, mikä pyrkii luomaan uuden sidoksen N4- ja C2-atomin välille siirtymätilan stw-ts1 kautta. Tämän jälkeen muodostuu tiolesteriväliaine (intmed). Tämän seurauksena H5:n toinen siirtyminen hydroksyyliryhmästä S1-atomiin tapahtuu stw-ts2:n kautta yhdessä S1-C2-sidoksen katkeamisen kanssa, mikä johtaa lopulta tuotteisiin.
(a)
(b)
(c)
(d)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Tulokset osoittavat, että kaikille siirtymätiloille on ominaista nelijäseninen rengasrakenne, joka on lähes tasomainen. Jokaisessa siirtymätilassa on kaksi pientä, alle 80°:n kulmaa (C2S1H5 ja S1C2N4 con-ts:lle, C2O3H5 ja C2N4H5 stp-ts1:lle, C2S1H5 ja S1C2O3 stp-ts2:lle), jotka tuovat koko systeemiin suuren rasituksen ja tekevät siitä epävakaan. Kaikkien substraattien kuudesta yhteensovitetusta siirtymätilasta (con-ts) C2N4-, N4H5- ja S1H5-sidoksen ominaisuudet ovat suunnilleen samat kaikilla substraateilla, kun taas S1:n ja C2:n välinen vuorovaikutus on yksi yhteensovitetun vaiheen määräävistä tekijöistä.
Asiat muuttuvat erilaisiksi asteittaisten polkujen osalta. C2-atomin hybridisaatiomuutokset noudattavat samankaltaista tendenssiä (𝑠𝑝3→𝑠𝑝2→𝑠𝑝3) kaikille substraateille vaiheittaisen asetyloinnin aikana (taulukko 1 lisäosa). H5:n ensimmäinen siirtyminen johtaa siirtymätilaan stp-ts1, minkä jälkeen potentiaalienergiapinnalla (PES), joka on paikallinen minimi, sijaitsee välitila nimeltä intmed. Se on tetraedrinen tiolesteriväliaine, kuten aiemmissa kokeellisissa tutkimuksissa on ehdotettu. Se on lyhytikäinen, ja siitä seuraava H5-siirto tapahtuu pian siirtymätilan stp-ts2 kautta. Vaiheittaisen polun osalta eri substraattien vetotilojen rakenteet eroavat toisistaan hyvin vähän. Siirtymätilojen 3D-rakenteet lueteltiin PABA:lle (kuva 2), muut olivat samankaltaisia.
3.3. Energiat
Kuuden substraatin kaikkien mahdollisten polkujen suhteelliset energiat suoritetaan nollaksi otetun reaktanttien energiasumman perusteella (kuva 3). Kuvasta 3 havaitaan, että koordinoituja polkuja suositaan vaiheittaisiin polkuihin nähden. Yhteensovitettujen siirtymätilojen (con-ts) energiaesteet ovat alhaisemmat kuin vaiheittaisten siirtymätilojen (stp-ts1) energiaesteet vaihteluvälillä 83,5 kJ/mol – 26,9 kJ/mol (taulukko 2, liite). Aryylihydratsiinit ovat parempia substraatteja kuin aryyliamiinit, ja HDZ on reaktiivisin ja sillä on alhaisin aktivaatioenergia, joka vastaa kokeellisia tietoja hyvällä yksimielisyydellä . Tämä johtopäätös voitiin tehdä myös rakennetietojen analyysin perusteella (taulukko 1, lisäosa). Lisääntynyt konjunktiovaikutus ja typen yksinäisten parien delokalisaatio selkärangassa vakautti siirtymätilan. Kaikkien substraattien bioaktiivisuus lisääntyy PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ-sekvenssissä.
Kiitokset
Tämä työ sai tukea Kiinan kansallisesta luonnontieteellisestä säätiöstä (no.20603030, no.20873074 ja no.10674114).), Kiinan tiede- ja teknologiaministeriön 973-projekti (nro 2009CB930103), Shandongin maakunnan luonnontieteellinen säätiö (nro Q2008B07) ja Ludongin yliopiston luovien tutkimusryhmien säätiö (nro 08-CXA001).
Täydentävät aineistot
Tämän artikkelin pituusrajoituksen vuoksi kaikkien aryyliamiinien ja aryylihydratsiinisubstraattien 3D-rakenteet, kaikkien siirtymätilojen päärakennetiedot ja eri reittien suhteelliset energiat koottiin täydentäviin aineistoihin.
- Täydentävät aineistot