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Introduction

Pour fournir une alimentation et une nutrition adéquates à la population mondiale qui devrait atteindre 9 milliards d’habitants en 2050 (http://www.unpopulation.org), les rendements en riz doivent augmenter d’au moins 60% (FAO 2009). Le riz est l’aliment de base de plus de la moitié de la population mondiale et cette population consommatrice de riz augmente au rythme de 1,098% par an (http://esa.un.org/wpp/Excel-Data/population.htm). L’augmentation de la population signifie une demande accrue de nourriture, d’eau et de terres à un moment où la base de ressources naturelles pour l’agriculture est en train de se dégrader parce que de grandes surfaces de terres agricoles sont détournées de la production alimentaire pour être utilisées pour l’industrialisation et la production de biocarburants. Un changement climatique imprévisible menace de réduire davantage les terres agricoles viables en raison de la multiplication des cas de sécheresse et d’inondation (http://www.fao.org/docrep/017/aq191e/aq191e.pdf). L’augmentation de la population et le changement climatique mondial exerçant une pression croissante sur l’approvisionnement alimentaire de la planète, il est essentiel de continuer à améliorer les performances des cultures en termes de productivité céréalière pour suivre le rythme de la croissance démographique. L’augmentation de la productivité des cultures conférée par les types de plantes créés pendant la période de la révolution verte a permis de soutenir le boom démographique qui a suivi les deux guerres mondiales. Depuis lors, malgré l’utilisation de variétés améliorées et de technologies avancées, le potentiel de rendement des cultivars de riz actuels s’est à peine amélioré, ce qui indique que ces variétés ont atteint un plafond de rendement (Akita 1994). Récemment, une tentative est en cours pour augmenter le potentiel de rendement du riz par l’ingénierie d’une photosynthèse efficace de type C4 dans le riz (Kajala et al. 2011). Pour cela, un ensemble de gènes qui régulent l’anatomie des feuilles et les processus biochimiques doivent être insérés dans le riz et exprimés de manière appropriée, ce qui n’est actuellement pas possible uniquement par les techniques conventionnelles de sélection végétale. Par conséquent, le génie génétique visant à améliorer la voie photosynthétique du riz permettrait d’améliorer la productivité réelle des grains ainsi que le potentiel de rendement. Le génie génétique fournit un outil de sélection efficace et précis dans lequel seuls les gènes d’intérêt peuvent être introduits, même à partir d’espèces éloignées.

Dans les plantes C3 comme le riz, le CO2 est assimilé en un composé à 3 carbones par l’enzyme photosynthétique ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase oxygénase (Rubisco). Comme son nom l’indique, la Rubisco catalyse également l’oxydation de la ribulose-1, 5-bisphosphate (RuBP) dans un processus de gaspillage connu sous le nom de photorespiration qui peut entraîner une perte allant jusqu’à 25 % du carbone précédemment fixé (Sage 2004). À une température supérieure à 30°C, ce qui est typique des zones tropicales de culture du riz dans le monde, le taux d’oxygénation augmente considérablement, ce qui réduit l’efficacité photosynthétique des plantes en C3 jusqu’à 40% (Ehleringer et Monson 1993). Ainsi, la photosynthèse du riz dans les régions tropicales et tempérées chaudes devient inefficace. Les plantes en C4, qui ont un mécanisme de concentration du CO2 dans leurs feuilles, ont des niveaux de photorespiration très réduits et ont donc évolué pour prospérer dans des environnements chauds et arides, et offrent des perspectives précieuses pour les stratégies d’amélioration des cultures. Le riz doté d’un mécanisme de photosynthèse en C4 aurait une efficacité photosynthétique accrue tout en utilisant plus efficacement des ressources rares comme la terre, l’eau et les engrais, en particulier l’azote (Hibberd et al. 2008). Parce qu’il se comportera bien sous des températures élevées ainsi que nécessitera moins d’eau et d’azote, le riz C4 conférerait des avantages à différents types d’écosystèmes rizicoles, y compris les terres marginales.

La photosynthèse de type C4 est l’un des trois types de mécanismes biochimiques adoptés par les plantes pour fixer le CO2 atmosphérique, les autres étant les voies C3 et le métabolisme des acides crassulacés (CAM). La photosynthèse C4 a évolué plus de 66 fois indépendamment (Sage et al. 2012) au moins dans 19 familles au cours de l’évolution des angiospermes à partir d’ancêtres C3 (Muhaidat et al. 2007) et elle implique des alternances de structures cellulaires, de biochimie et donc le développement des feuilles. Cette forme hautement spécialisée de photosynthèse a essentiellement développé un mécanisme de concentration du CO2 autour de l’enzyme Rubisco, éliminant ainsi la fonction oxygénase de la Rubisco et réduisant le gaspillage d’énergie dû à la photorespiration (Douce et Heldt 2000). La Rubisco des espèces C4 est plus efficace que celle des espèces C3 en termes de carboxylation (Kubien et al. 2008). Les autres avantages associés au système C4 comprennent une plus grande efficacité d’utilisation de l’eau car un gradient de concentration plus raide pour la diffusion du CO2 peut être maintenu à travers des stomates partiellement fermés, une plus grande efficacité d’utilisation du rayonnement car l’efficacité de la photosynthèse en C4 n’est pas saturée à une intensité lumineuse élevée (Rizal et al. 2012) et une plus grande efficacité d’utilisation de l’azote car elle nécessitera moins de Rubisco et donc moins d’azote.

Les plantes C4 sont potentiellement plus productives à des températures plus élevées que connaît généralement le riz. Pour tirer parti de ce système photosynthétique plus efficace à une époque où la population et les prix des aliments montent en flèche, on s’efforce d’insérer dans le riz le mécanisme C4 tel qu’on le trouve dans le maïs (Rizal et al. 2012). Cette nouvelle approche pour modifier le système de photosynthèse du riz est un défi et une entreprise de longue haleine car la voie C4 est très complexe et de nombreux facteurs contrôlant le mécanisme sont encore inconnus. Par conséquent, elle nécessite l’ingéniosité et l’expertise de scientifiques impliqués dans diverses disciplines telles que le génie génétique, la biochimie, la bioinformatique, la biologie moléculaire, la photosynthèse, la biologie des systèmes, la physiologie, la sélection végétale, la métabolomique, etc. Pour la même raison, le consortium du riz C4 a été conceptualisé et établi et a commencé le travail pratique de l’ingénierie du riz C4 depuis 2009 (http://photosynthome.irri.org/C4rice/). Cette revue fait le point sur les conditions requises pour développer le riz C4 et les progrès réalisés dans le domaine du génie génétique. Sur la base de l’étude de l’évolution du C4 à partir des espèces C3 et des changements associés, les modifications suivantes sont essentielles pour établir une voie photosynthétique C4 fonctionnelle dans le riz.

Augmenter le nombre et la taille des chloroplastes dans les cellules de la gaine du faisceau du riz

Dans le riz, plus de 90% des chloroplastes totaux sont situés dans les cellules du mésophylle (MCs) à l’intérieur de la feuille (Yoshimura et al. 2004) ; alors que, dans les plantes C4, les MCs et les cellules de la gaine du faisceau (BSCs) possèdent un nombre égal de chloroplastes (Figure 1A et B). Cela s’explique par le fait que chez les plantes C3, l’ensemble du processus de photosynthèse a lieu dans les CM, mais que chez les plantes C4, le processus de photosynthèse est compartimenté entre les CM et les CBA. Les MCs effectuent la première fixation du CO2 au cours de laquelle un composé à 4 carbones appelé oxaloacétate est formé et celui-ci est converti en acides C4 tels que le malate qui est transporté dans les BSCs permettant ainsi une assimilation efficace du CO2 en hydrates de carbone par le cycle de Calvin dans les BSCs. Par conséquent, contrairement aux plantes C3, les BSC des plantes C4 ont des fonctions photosynthétiques telles que la décarboxylation du composé C4 et le processus du cycle de Calvin. Pour réaliser ces processus, les BSC des plantes C4 sont agrandies et possèdent plus de chloroplastes, ce qui rend les BSC plus prononcées et actives sur le plan photosynthétique. Les BSC des espèces C3 ont pour fonction d’équilibrer la pression hydraulique, d’empêcher l’entrée d’air des espaces intercellulaires vers le xylème, de fournir un réservoir d’eau pour tamponner les pertes dues à la transpiration, de permettre l’entrée et la dispersion dans la feuille de la lumière de plus forte intensité qui frappe les nervures (Nikolopoulos et al. 2002). Les fonctions supplémentaires des BSC des plantes C3 comprennent le transport de l’azote, du soufre, des hydrates de carbone et le rôle dans la voie de signalisation qui a été largement examiné dans (Leegood 2008). Chez les espèces C4, les BSC et les MC coopèrent dans une version en deux étapes de la photosynthèse. Par conséquent, pour assurer un contact direct entre les BSC et les MC, les plantes C4 possèdent un type particulier d’anatomie foliaire accompagné d’une prolifération de chloroplastes dans les BSC. Pour introduire la voie C4 dans le riz, il faut plus de chloroplastes photosynthétiques dans les BSC que le riz n’en possède actuellement. Cela pourrait être fait en surexprimant les éléments génétiques qui sont nécessaires au développement des chloroplastes tels que les gènes Golden2-like (GLK) d’une manière spécifique aux cellules en utilisant les promoteurs des gènes C4 tels que le promoteur de la phosphoénol pyruvate carboxylase (PEPC) de Zea mays pour l’expression spécifique des MC et le promoteur de la phosphoénol pyruvate carboxykinase (PCK) de Zoysia japonica pour l’expression spécifique des BSC dans les feuilles de riz (Matsuoka et al. 1994 ; Nomura et al. 2005).

Les membres de la famille des gènes de type GLK (Golden2-like) codent pour des facteurs de transcription nucléaires qui ont été impliqués dans la régulation du développement des chloroplastes chez Arabidopsis, Zea mays et la mousse Physcomitrella patens (Rossini et al. 2001). Dans chacune de ces espèces, les gènes GLK existent sous la forme d’une paire homologue appelée GLK1 et GLK2 (Waters et al. 2009). Chez la mousse et Arabidopsis, les gènes GLK sont redondants et fonctionnellement équivalents, tandis que chez le maïs et le sorgho, les gènes GLK agissent de manière spécifique au type de cellule pour diriger le développement des chloroplastes dimorphiques (Waters et al. 2008 ; Wang et al. 2013a). Chez le maïs, les transcrits de Golden2 (G2) et de son homologue ZmGLK1 s’accumulent principalement dans les cellules BS et M, respectivement, ce qui suggère un rôle spécifique pour chaque gène régulant la différenciation des chloroplastes dimorphes (Wang et al. 2013a).

Réduire l’espacement des veines augmentant ainsi la densité des veines dans la feuille

Dans les espèces C3, la photosynthèse a lieu dans les MCs. Un nombre élevé de MCs entre les veines consécutives (Figure 1A) pousse les veines loin les unes des autres augmentant ainsi l’espacement des veines ou réduisant la densité des veines. Dans les feuilles de riz, il y a moins de 6 veines par mm (Figure 2A), Setaria viridis et le sorgho (deux espèces typiques de C4) ont plus de 7 veines par mm (Figure 2B et C). Les feuilles C4 ont en moyenne 2 MCs entre les veines (Figure 1B). La plus grande densité de veines dans les feuilles des plantes C4 conduit à un rapport presque égal entre les volumes des tissus M et BS. L’anatomie interne d’une feuille C4 est souvent composée d’un motif répétitif de veine-BS-M-M-BS-veine. Les BSC entourées de MC forment une structure en forme de couronne ; ce type d’anatomie foliaire a été appelé « anatomie de Kranz » par le botaniste allemand G. Haberlandt. Les BSC C4 ont un cytoplasme dense et sont remplies d’un grand nombre de chloroplastes (Figure 1B). Pour le fonctionnement efficace de la voie C4, un contact étroit entre les cellules M et BS est indispensable et celles-ci sont étroitement interconnectées les unes aux autres par un grand nombre de plasmodesmes Dengler et (Nelson 1999). L’anatomie de Kranz se retrouve avec peu de variation dans presque toutes les lignées monocotylédones et dicotylédones qui utilisent le mode bicellulaire de la voie photosynthétique C4. Les études sur l’anatomie et la morphologie des feuilles ont révélé plusieurs gènes responsables de la croissance, du développement ou des déformations des cellules des feuilles. Un gène ACAULIS1 était responsable de l’allongement des cellules des feuilles (Tsukaya et al. 1993). La mutation du gène CURLEY LEAF (CLF) a produit des feuilles frisées chez Arabidopsis (Kim et al. 1998). L’augmentation de la terminaison des veines libres, le motif de nervation ouvert et la structure arrondie des feuilles ont été causés par le gène rotunda 1 (RON1) (Robles et al. 2010). La mutation du gène Scarecrow chez le maïs a montré une augmentation du nombre de BSC, une différenciation inhabituelle du chloroplaste BS, une diminution des veines mineures et une altération de la densité des veines (Slewinski et al. 2012). Ces études relatives à la configuration anormale des veines causée par la mutation de certains gènes fournissent des indices sur la façon dont l’anatomie de Kranz est régulée et suggèrent l’implication de plusieurs voies dans le développement du motif de Kranz. Il a été déterminé que le réseau de régulation SCARECROW/SHORTROOT est l’un des composants importants nécessaires à la formation du motif de l’anatomie de Kranz, car les feuilles des plantes C3 avec le gène Scarecrow muté étaient normales, alors que chez les plantes C4, la mutation du même gène endommageait l’anatomie de Kranz (Slewinski et al. 2012 ; Wang et al. 2013b). Récemment, il a été montré que l’introduction de chromosomes de maïs dans l’avoine pouvait augmenter la taille des BSC et réduire l’espacement des nervures dans les feuilles d’avoine C3, ce qui démontre que l’anatomie de la feuille C3 peut être modifiée (Tolley et al. 2012). En outre, un grand effort a été déployé pour cribler des mutants de sorgho (C4) avec un espacement accru des veines et des mutants de riz (C3) avec un espacement réduit des veines afin que les gènes contrôlant le trait d’espacement des veines puissent être identifiés (Rizal et al. 2012).

L’activité du cycle de Calvin devrait être significativement réduite dans le MC et fortement augmentée dans le BSC du riz

La photosynthèse C4 est caractérisée par un mécanisme biochimique de pompage du CO2 qui élève la concentration de CO2 au site de la Rubisco. Un niveau élevé de CO2 autour de la Rubisco réduit le taux de photorespiration et augmente l’assimilation nette de CO2 conduisant à une photosynthèse hautement efficace Weber et von (Caemmerer 2010). Pour y parvenir, l’assimilation du CO2 en C4 est répartie sur deux types de cellules, les MCs et les BSCs (Figure 3). Par conséquent, la fixation du carbone en C4 dépend de l’expression et de la localisation des gènes spécifiques aux cellules. Les cellules BS et M voisines, photosynthétiquement actives, interagissent pour éliminer la fixation de l’O2 catalysée par la Rubisco. Chez les plantes bicellulaires de type C4, le CO2 est d’abord fixé en acide C4 appelé oxaloacétate dans les MC par une carboxylase insensible à l’O2 appelée phosphoenol pyruvate carboxylase (PEPC, EC 4.1.1.31). L’oxaloacétate est ensuite converti en malate ou en aspartate et est transporté vers les BSC où il est décarboxylé et où le CO2 est libéré. Ce CO2 est refixé par la Rubisco et toutes les activités ultérieures du cycle de Calvin ont lieu dans le chloroplaste des BSC (Nelson et Langdale 1989). Par conséquent, pour que le riz C4 fonctionne, l’activité de la Rubisco doit être fortement réduite dans les MC et augmentée dans les BSC, ce qui confine le cycle de Calvin aux BSC du riz, comme dans un système C4. D’autre part, certains gènes codant pour les enzymes C4, tels que la β-anhydrase carbonique (CA) et la PEPC, doivent être surexprimés dans le cytosol des MC du riz afin de faciliter la fixation primaire du CO2, de sorte que le CO2 puisse être concentré et fourni à la Rubisco dans les BSC. Le cycle C4 implique également un transport important de métabolites à travers la membrane de l’enveloppe du chloroplaste et le plasmalemme des MC et BSC (Figure 3). Ainsi, en plus des principales enzymes C4, à savoir l’AC, la PEPC, la pyruvate orthophosphate (Pi) dikinase (PPDK, EC 2.7.9.1), la malate déshydrogénase dépendante du NADP (NADP-MDH, EC 1.1.1.82) et l’enzyme malique dépendante du NADP (NADP-ME, EC 1.1.1.40), la voie C4 nécessite également l’insertion de transporteurs de métabolites pour l’oxaloacétate, le malate, le triose-phosphate et le pyruvate dans le riz pour fournir une capacité de transport accrue pour les intermédiaires du cycle C4 afin que le cycle de Calvin puisse fonctionner efficacement dans les BSC (Weber et von Caemmerer 2010).

La photorespiration dans les cellules du mésophylle doit être fortement réduite

Dans les plantes C3, la fixation du carbone et le cycle de Calvin ont lieu dans les MC. Pendant la fixation du carbone, le ribulose- 1, 5- bisphosphate (RuBP) – un composé à cinq carbones, catalysé par une enzyme ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase oxygénase (Rubisco, EC.4.1.1.39) réagit avec le CO2 pour former deux molécules de composé à 3 carbones appelé le 3-phosphoglycérate (3-PGA). Dans le cycle de Calvin, les deux molécules de PGA forment une molécule de sucre riche en énergie (triose phosphate) et régénèrent le RuBP pour le cycle suivant. Aux concentrations actuelles de CO2 atmosphérique (environ 400 ppm), la Rubisco catalyse également une réaction entre le RuBP et l’O2, ce qui produit une molécule de 2-phosphoglycolate et une molécule de 3-PGA (Peterhansel et Maurino 2011). Le 2-phosphoglycolate doit être reconverti en 3-PGA par un processus appelé photorespiration, qui implique une série de réactions biochimiques. Au cours de ce processus, une perte de carbone et d’azote précédemment fixés se produit et une énergie supplémentaire doit également être utilisée (Sharpe et Offermann 2013).

Les plantes C4 ont développé des mécanismes pour restreindre la localisation et les activités de la Rubisco dans les BSC. Les MCs empêchent spatialement le contact entre la Rubisco dans les BSCs et l’O2 dans les espaces intercellulaires, empêchant ainsi la perte d’énergie par photorespiration. L’élimination de la photorespiration par les plantes C4 est mise en évidence par leur très faible point de compensation du CO2, qui est presque nul, et par leur efficacité de carboxylation (EC) constamment élevée, sans réponse aux changements de concentration en O2 (figure 4). En revanche, chez les plantes C3, avec le changement de la concentration en O2 de 21% à 2%, le point de compensation a significativement diminué de 55 à 30 ppm (Tableau 1). Dans la figure 4, l’EC a été calculé selon (Li et al. 2009) qui a montré que l’EC du sorgho n’a pas changé de manière significative avec le changement du niveau d’O2, mais dans le riz il y avait une amélioration très significative de l’EC lorsque le niveau d’O2 a été diminué de 21 à 2% (figure 4 et tableau 1). L’augmentation de l’EC dans le sorgho n’était que de 6,1 % alors que celle du riz était de 41,5 % avec la diminution de la concentration intercellulaire d’O2 à 2 % (Tableau 1). Ces données montrent qu’il existe un grand potentiel pour augmenter la capacité photosynthétique du riz en diminuant la photorespiration, ce qui permettrait d’augmenter considérablement le rendement. Une façon de réduire la photorespiration dans les MC est de réduire la protéine glycine décarboxylase (GDC) dans les MC et de limiter son accumulation dans les BSC de sorte que la décarboxylation de la glycine se produise exclusivement dans les BSC, générant ainsi une concentration plus élevée de CO2 dans les BSC, similaire à celle des intermédiaires C3-C4 (Monson et Rawsthorne 2000). Le consortium du riz C4 teste cette approche en utilisant un microARN artificiel conçu contre la sous-unité GDC-H du riz qui est piloté par le promoteur ZmPEPC (Kajala et al. 2011). Un tel mécanisme biochimique nécessite une spécialisation cellulaire des BSC qui inclut une augmentation du nombre de chloroplastes et de mitochondries enrichissant le contenu organite des BSC de riz pour aider à la capture du CO2 libéré par la décarboxylation de la glycine par la GDC (Ueno 2011). Une autre approche qui a réussi à capturer le CO2 libéré par la photorespiration vers le site de la photosynthèse est le transfert de la voie catabolique du glycolate d’Escherichia coli vers les chloroplastes d’Arabidopsis thaliana dans lequel le glycolate dans le chloroplaste a été directement converti en glycérate (Kebeish et al. 2007). Cette stratégie qui a réduit la photorespiration et amélioré la photosynthèse chez Arabidopsis a impliqué une transformation nucléaire par étapes avec cinq gènes bactériens ciblés sur le chloroplaste codant pour la glycolate déshydrogénase, la glyoxylate carboligase et la tartronique semialdéhyde réductase pourrait être appliquée à d’autres plantes C3 comme le riz, cependant, l’utilisation de gènes bactériens pourrait ne pas être préférée dans l’ingénierie du riz C4.

Ingénierie de la voie C4 dans le riz

On a pensé que le système C4 unicellulaire pourrait être plus rapide à installer dans les plantes C3. Il y a des tentatives d’ingénierie du système de photosynthèse C4 unicellulaire dans le riz aussi (Miyao et al. 2011). Pour introduire une voie unicellulaire de type C4 dans laquelle le MC est amené à capturer et à libérer du CO2 de la même manière que chez Hydrilla verticillata (L.f) Royle, quatre enzymes (PEPC, PPDK, NADP-MDH, et NADP-ME) impliquées dans la voie ont été surproduites dans les feuilles de riz transgéniques (Ku et al. 1999 ; Fukayama et al. 2001 ; Tsuchida et al. 2001 ; Taniguchi et al. 2008). Quelques-uns des principaux problèmes rencontrés qui doivent être résolus pour créer une voie unicellulaire de type C4 dans le riz sont : le mécanisme pour faciliter l’activité de transport du PEP à travers l’enveloppe du chloroplaste, l’importation de l’OAA dans les chloroplastes et la direction de la réaction NADP-ME, l’implication de la NADP-MDH, la présence de la PEPC endogène à l’intérieur du chloroplaste MC du riz et une augmentation supplémentaire de l’activité de la NADP-MDH ont été signalés comme étant nécessaires (Miyao et al. 2011). Les espèces C4 terrestres unicellulaires telles que Bienertia cycloptera, B. sinuspersici et Suaeda aralocaspica, appartenant à la famille des Chenopodiaceae, ont également besoin d’une compartimentation spatiale de l’assimilation et de la décarboxylation du carbone (Chuong et al. 2006). Ces espèces ont des chloroplastes dimorphiques dans ces compartiments. Les tentatives précédentes ont produit un cycle futile qui était dû à l’absence de changement dans l’anatomie, le manque de transporteurs appropriés et les gènes de maïs transformés en riz n’étaient pas exprimés de manière appropriée dans la cellule spécifique et n’étaient pas régulés comme dans le maïs, mais étaient régulés comme les isoformes C3 endogènes du riz (Miyao et al. 2011).

Pour faire évoluer la voie photosynthétique de C3 à C4 en deux décennies, ce qui a pris des millions d’années dans la nature, le consortium du riz C4 a commencé la découverte de gènes et l’ingénierie simultanée de gènes déjà connus dans le riz visant à former un riz C4 avec une anatomie de type Kranz. Les gènes C4 tels que CA, PEPC, PPDK, NADP-ME, et NADP-MDH sont clonés à partir du maïs et transformés en riz. De même, les transporteurs qui ont été surexprimés dans les voies métaboliques C4 tels que 2-oxoglutarate/malate transporter (OMT1), dicarboxylate transporter1 (DiT1), dicarboxylate transporter2 (DiT2), PEP/phosphate transporter (PPT1), mesophyll envelope protein (MEP) et triose-phosphate phosphate translocator (TPT) qui ont été récemment identifiés par la protéomique des cellules BS et MS du maïs (Friso et al. 2010) sont en cours de transformation dans le riz (Figure 3). Les membres du consortium C4 pour le riz sont également impliqués dans la découverte de nouveaux gènes liés à l’anatomie de Kranz (Wang et al. 2013b). Une fois testés, les gènes candidats prometteurs contrôlant l’anatomie de Kranz seront également introduits dans les plantes de riz qui ont été modifiées avec les gènes de la voie biochimique C4.