3.1.2 Azides
L’azide est considéré comme l’un des groupes les plus adaptés aux réactions bioorthogonales et au but de la chimie click. Contrairement aux cétones et aux aldéhydes, il n’y a pratiquement pas d’azides dans les systèmes biologiques. Les azides possèdent une énergie intrinsèque élevée mais aucun partenaire réactionnel naturel (King et Wagner, 2014), ils ont de petites tailles et une charge globale neutre, et enfin ils sont cinétiquement stables dans des conditions physiologiques.
La ligature de Staudinger (Staudinger et Hauser, 1921) semble être un bon candidat pour les réactions de bioconjugaison utilisant des azides. Dans cette réaction, les azides réagissent avec des réactifs triphénylphosphine contenant un piège électrophile pour produire un intermédiaire aza-ylide qui réagit avec le groupe carbonyle ester électrophile en formant un cycle à cinq chaînons qui subit une hydrolyse pour générer une liaison amide stable finale (Fig. 5.6A) (Steen Redeker et al., 2013 ; Staudinger et Hauser, 1921). Une nouvelle variante de cette réaction a été décrite peu après (King et Wagner, 2014 ; Saxon et Bertozzi, 2000 ; Saxon et al., 2000 ; Nilsson et al., 2000), appelée » ligature de Staudinger sans trace « , où le produit final lié à l’amide est libéré de la fraction oxyde de phosphine.
Figure 5.6. Exemples de réactions de bioconjugaison avec des azides. (A) ligature de Staudinger ; (B) cycloaddition azide-alkyne catalysée par le cuivre ; (C) cycloaddition azide-alkyne promue par la souche ; (D) cycloaddition avec des oxanorbornadiènes. UAA, acides aminés non naturels.
La ligature de Staudinger a été employée dans une variété d’applications. Par exemple, Raines et al. ont appliqué cette réaction comme alternative sans cystéine à la NCL pour la ligature de peptides (Nilsson et al., 2001) et en combinaison avec la NCL dans l’assemblage de l’ARNase A artificielle (Nilsson et al., 2005). En outre, il a été utilisé dans d’autres applications, telles que l’immobilisation de protéines sur un support solide pour l’imagerie in vitro et in vivo (Saxon et Bertozzi, 2000 ; Prescher et al., 2004), le marquage de biomolécules in vitro et in vivo (Saxon et Bertozzi, 2000 ; Prescher et al, 2004 ; Vocadlo et al., 2003), l’enrichissement (Vocadlo et al., 2003) et la détection (Charron et al., 2009) des protéines, ainsi que (Lemieux et al., 2003) la modification des protéines.
Néanmoins, la ligature de Staudinger présente quelques inconvénients. A savoir, sa cinétique lente (constante de vitesse du second ordre dans la gamme basse de 10-3 M-1s-1) (Lin et al…, 2005), la labilité à l’oxydation des composés phosphines (nécessité d’utiliser des concentrations relativement élevées du réactif phosphine), et le potentiel de réactivité croisée des phosphines avec les disulfures (Lang et Chin, 2014 ; King et Wagner, 2014).
Les azides peuvent réagir avec des alcynes dans une cycloaddition azide-alkyne catalysée par Cu(I) (CuAAC) ou une cycloaddition 1,3-dipolaire (Fig. 5.6B), l’un des exemples les plus standards de réactions de chimie click (Rostovtsev et al…, 2002 ; Tornøe et al., 2002). Cette réaction présente un grand intérêt dans les sciences biologiques en raison de sa bonne sélectivité, de son rendement élevé et de ses conditions de réaction douces (température ambiante dans divers solvants). De plus, les azides et les alcynes sont introduits dans les protéines sans affecter la structure et la fonction des protéines (Steen Redeker et al., 2013). L’azide et l’alcyne peuvent former très rapidement une liaison 1,2,3-triazole stable dans des conditions physiologiques, en présence de Cu(I). Le mécanisme proposé par Sharpless et al. (Rostovtsev et al., 2002) décrit d’abord l’introduction de l’alcyne terminal dans un acétylure de cuivre et une attaque ultérieure de l’azide (King et Wagner, 2014). Récemment, ce mécanisme a été affiné et un intermédiaire dicopper a été proposé (Worrell et al., 2013). Les principaux inconvénients de cette réaction sont les réactions secondaires dépendantes du Cu(I) et la cytotoxicité du Cu(I) (Baskin et al., 2007 ; Plass et al., 2011), qui ont limité son application principalement pour le marquage dans l’espace extracellulaire (King et Wagner, 2014). Le CuAAC a été largement utilisé dans de nombreuses études biologiques différentes, par exemple, pour marquer les phospholipides pour leur imagerie in vivo (Jao et al., 2009) et in vitro (Neef et Schultz, 2009), pour le remodelage de la surface des virus (Steinmetz et al.., 2009), à modifier/étiqueter les protéines in vitro et in vivo (Link et Tirrell, 2003 ; Ngo et Tirrell, 2011 ; Liu et Schultz, 2010 ; Deiters et al., 2003), à marquer les acides nucléiques (Weisbrod et Marx, 2008), et au profilage de sondes par affinité (Speers et al., 2003).
Différentes approches ont été développées pour surmonter la cytotoxicité du cuivre. Il s’agit de l’utilisation de ligands hydrosolubles pour la coordination de Cu(I), de l’utilisation d’azides organiques chélateurs de cuivre et de l’introduction d’une contrainte cyclique dans la fraction alcyne. Dans le premier cas, les ligands hydrosolubles coordonnent Cu(I) pour former un catalyseur de cuivre activé capable de promouvoir le CuAAC à de faibles concentrations micromolaires de métal en réduisant en même temps la toxicité potentielle de Cu(I) (Besanceney-Webler et al., 2011 ; Del Amo et Wang, 2010 ; Hong et al., 2009 ; Kennedy et al., 2011). Dans le second cas, la concentration effective de Cu(I) est augmentée au niveau du site de réaction en utilisant des ligands azides contenant un fragment chélateur de cuivre interne (Brotherton et al., 2009 ; Kuang et al., 2010 ; Uttamapinant et al., 2012). La dernière stratégie consiste à utiliser des alcynes, qui ont été activés pour réagir avec une cinétique améliorée en l’absence de catalyseur. À cet égard, l’utilisation de fragments de cyclooctyne augmente la réactivité en raison de la libération de la souche (Steen Redeker et al., 2013 ; Baskin et al., 2007 ; Plass et al., 2011). La cycloaddition azide-alkyne promue par la souche (SPAAC) (Fig. 5.6C) est devenue un outil puissant non seulement pour le marquage des protéines et des anticorps, mais aussi pour d’autres applications telles que l’analyse Western Blot sans anticorps (Boutureira et al., 2015), car des réactifs supplémentaires ou des métaux toxiques susceptibles d’endommager les biomolécules ne sont pas nécessaires. Par exemple, Bertozzi et al. ont prouvé son applicabilité à la modification de protéines purifiées (Baskin et al., 2007). Dans d’autres expériences, la réaction a été appliquée avec succès in vitro à des cellules fibroblastes (Baskin et al., 2007). En outre, la SPAAC a été utilisée pour visualiser des tumeurs chez des souris vivantes à l’aide de nanoparticules (Koo et al., 2012) et de la TEP au 18F où le fluor était attaché à la fois à l’azide et au cycloalkyne (Jeon et al., 2012). D’autres champs d’application ont été trouvés dans la modification des virus et le marquage de l’ADN (Qiu et al., 2013). Cependant, la synthèse complexe des cyclooctynes et le fait que leur encombrement et leur hydrophobie accrus peuvent affecter la structure et la stabilité des protéines (Kim et al…, 2013), et le fait que leur activation accrue peut favoriser les réactions secondaires avec les thiols naturels peuvent être considérés comme des inconvénients.
Les sulfonylazides déficients en électrons peuvent également réagir avec des alcènes activés (oxanorbornadiènes ou norbornènes) dans une cycloaddition sans métal (Fig. 5.6D), similaire à la SPAAC (Alder, 1930 ; Huisgen et al., 1980). Cependant, le produit des cycloadditions azide-alcène est une triazoline relativement instable contrairement aux triazoles aromatiques formés dans la cycloaddition click classique. Un oxanorbornadiène qui est à la fois tendu et déficient en électrons a été utilisé comme dipolarophile dans une réaction avec des azides (van Berkel et al., 2008). Dans ce cas, la double liaison contrainte dans l’oxanorbornadiène réagit avec des azides pour former une triazoline intermédiaire qui subit spontanément une réaction de rétro-Diels-Alder, avec libération de furane, conduisant à des 1,2,3- ou 1,4,5-triazoles stables. Cette réaction a été utilisée pour bioconjuguer sélectivement une protéine fonctionnalisée par un oxanorbornadiène et un peptide cyclique modifié par un azide dans des tampons aqueux. Bien que les oxanorbornadiènes soient plus faciles à synthétiser que leurs homologues cyclooctynes, cette réaction de cycloaddition est assez lente et n’est pas entièrement chimiosélective par rapport aux autres groupes fonctionnels présents dans les protéines, ce qui a pu limiter son utilisation à grande échelle (Lang et Chin, 2014 ; van Berkel et al., 2008).