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La protéine de capside majeure P74-26 utilise des caractéristiques architecturales uniques-lassos, anneaux et volets-pour améliorer la stabilité de la capside. Nous observons des interactions hydrophobes renforcées aux interfaces sous-unité-sous-unité au sein de la capside. Les interactions hydrophobes sont estimées être >2 fois plus élevées pour la P74-26 que pour les autres homologues mésophiles (tableaux supplémentaires 3 et 4). Cette observation peut expliquer en partie la thermostabilité accrue de la capside P74-26, car l’effet hydrophobe augmente en force à haute température32. En revanche, nous n’observons aucune altération significative du nombre de liaisons hydrogène ou de ponts salins (tableaux supplémentaires 3 et 4), d’autres interactions dont on a vu qu’elles conféraient une thermostabilité à certaines protéines globulaires33,34,35,36.

Nous n’avons pas été particulièrement surpris de constater une augmentation des interactions hydrophobes dans la capside de la P74-26. De nombreuses études de protéines globulaires thermophiles montrent des forces hydrophobes accrues comme un contributeur majeur à la stabilité thermique33,37,38,39,40. Cependant, deux éléments font de la capside de la P74-26 un système modèle unique : (1) la pression interne élevée de l’ADN étroitement emballé induit une contrainte mécanique dans la capside7,8,27 et (2) il s’agit d’une structure auto-assemblée dans laquelle l’architecture et la topologie inter-sous-unités jouent un rôle important dans la stabilité globale. Nous pouvons déduire ces principes en comparant la structure de la P74-26 avec celles de nombreux homologues mésophiles.

Nous constatons que la capside de la P74-26 est stabilisée par plusieurs boucles et extensions qui forment des liens topologiques entre les sous-unités. Le lasso unique de la boucle E s’attache à la boucle G et au domaine P d’une MCP voisine, qui agissent comme un poteau d’attelage pour attacher topologiquement le lasso. De plus, les bras N et C, ainsi que le bras Dec, entourent complètement les β-brins de la boucle E, un autre élément architectural unique à la P74-26 (Fig. 5e). Ainsi, la boucle E est annelée vers la base et en lasso vers la pointe.

Un second lasso est formé par le bras N, qui forme des interactions intra-capsomères et inter-capsomères. Le bras N se lie à la boucle E d’un MCP voisin au sein d’un capsomère par le biais du brin supérieur du bras, de l’hélice de l’avant-bras et de la région de la main (Fig. 5a, c). En outre, le coude, l’avant-bras et la main stabilisent les interactions capsomère-capsomère en se liant à DecP74-26 et à une sous-unité MCP qui se trouve de part et d’autre de l’axe double/quasi double (Fig. 6a, b). Bien que le bras N ne soit techniquement pas une boucle fermée, la P74-26 ferme effectivement la boucle en utilisant la boucle S unique pour fixer la position des régions de l’avant-bras et de la main (Fig. 6c). Nous ne trouvons pas d’architecture lasso similaire dans le bras N des Caudovirus mésophiles31,41,42,43,44,45,46, ce qui suggère que cette architecture est importante pour améliorer la stabilité de la capside.

Bien que les lassos ne soient pas trouvés dans d’autres Caudovirus, les herpèsvirus lointainement apparentés contiennent une architecture lasso analogue dans le bras N du pli HK9747,48,49. Tout comme le bras N de la P74-26, les lassos du bras N des herpèsvirus ne sont pas de véritables boucles fermées. Malgré cette similitude apparente, les lassos des herpèsvirus fonctionnent différemment. Ils stabilisent exclusivement les interactions inter-capsomères, alors que le lasso du bras N de la P74-26 stabilise à la fois les interactions intra-capsomères et inter-capsomères. En outre, les pentons des capsides d’herpèsvirus ne présentent pas d’interactions lasso et les interactions sont variables au sein des sous-unités hexon, alors que la P74-26 présente des interactions lasso presque identiques dans les pentons et les hexons. Ces observations indiquent que l’architecture lasso a probablement évolué de manière indépendante et souligne la flexibilité des mécanismes de stabilisation topologique. Nous supposons que l’architecture de bras extensible facilite l’évolution d’interactions plus fortes au sein de systèmes auto-assemblés tels que les capsides. Ces boucles ouvertes peuvent être facilement améliorées par l’extension en série d’un seul résidu. Cette facilité d’évolution explique peut-être pourquoi on trouve des lassos à bras allongés dans la P74-26 et les herpèsvirus. Ces lassos étendus sont similaires aux extensions N- et C-terminales qui médient l’assemblage dans d’autres virus (c’est-à-dire les extensions C-terminales dans les protéines d’enveloppe de la capside du SV4050). Nous anticipons que ces types de lassos étendus peuvent être utiles pour l’ingénierie de capsides plus stables et d’autres particules auto-assemblées.

Un autre avantage de l’architecture lasso est qu’elle peut adopter une conformation moins étendue. Le MCP P74-26 possède deux lassos à chaque extrémité du pli HK97, tous deux vraisemblablement présents dans la procapside beaucoup plus petite. En utilisant ces structures lasso, la P74-26 peut conserver une grande stabilité, tout en offrant une flexibilité conformationnelle pour s’étendre pendant la maturation. Nous supposons que les lassos sont moins étendus dans la procapside ; lors de l’expansion de la capside, les lassos atteignent leur pleine extension, où ils se verrouillent en place. L’extension complète observée dans la capside mature fournirait une intégrité tensionnelle, comme nous le discutons ci-dessous.

La protéine P74-26 utilise des rabats entrelacés pour stabiliser topologiquement les contacts inter-capsomères. La boucle en T stabilise les interactions inter-capsomères en s’insérant dans un sillon sur le domaine P d’une sous-unité MCP dans un capsomère voisin. Ces interactions de boucle en T sont trouvées en anneau autour des axes triples/quasi- triples le long de la face interne de la capside (Fig. 7b ; Fig. 7b supplémentaire). De même, les interactions doubles/quasi doubles inter-capsomères sont stabilisées sur la face externe de la capside par l’arrangement entrelacé des bras N (Fig. 7c ; Supplementary Fig. 7a). Ces structures superposées ressemblent à l’agencement entrelacé de rabats sur le dessus d’une boîte en mouvement. De cette manière, les faces extérieures et intérieures de la capside sont stabilisées par deux interactions distinctes de rabats imbriqués. Nous proposons que les arrangements de boîtes mobiles observés sur les axes de symétrie et de quasi-symétrie renforcent considérablement la capside contre la pression interne, car ils sont topologiquement difficiles à perturber. Cependant, ces arrangements sont aussi vraisemblablement difficiles à assembler, ce qui soulève la question importante de savoir comment la capside P74-26 s’assemble avec une architecture entrelacée.

La protéine de décoration P74-26 adopte de même un arrangement structurel unique, contribuant de manière substantielle à la thermostabilité de la capside. Les protéines de décoration augmentent la stabilité de la capside28,29,51, bien que des rôles supplémentaires aient été postulés52. Les axes triples/quasi- triples sont stabilisés par le trimère DecP74-26. Par rapport aux Caudovirus mésophiles, le trimère DecP74-26 interagit avec un plus grand nombre de sous-unités sur une zone d’interaction beaucoup plus grande (Fig. 8a). La zone d’interaction totale par sous-unité DecP74-26 est tout à fait remarquable : ~4100;Å2 pour une protéine de 146 résidus. Notre étude précédente a montré que DecP74-26 est nettement plus stable que ses homologues mésophiles, et que cette stabilisation passe principalement par la formation d’un trimère extraordinairement serré23. Cependant, les interactions de trimérisation ne représentent qu’une petite fraction de la zone d’interaction totale de DecP74-26 (~18% de la zone d’interaction totale par sous-unité DecP74-26). Cela suggère que l’interaction de DecP74-26 avec la capside contribue à une quantité substantielle de stabilité.

Les interactions entre les trimères de DecP74-26 forment une cage maintenant la capside ensemble (Fig. 8b). Cet arrangement est unique à la P74-26. Par exemple, les phages lambda et TW1 utilisent un pli de protéine de décoration très similaire23, mais l’interaction de leur bras Dec avec d’autres protéines de capside est beaucoup plus limitée29,44. En outre, la protéine de décoration non apparentée du phage L ne se connecte pas avec les trimères voisins, et en fait, elle est absente au niveau des axes quasi-triples52. Le phage T4 est décoré avec la protéine Soc qui interagit avec les sous-unités Soc voisines au niveau des axes triples et quasi triples ; cependant, Soc est présent en occupation relativement faible (~50%), la cage est donc incomplète41. Comme les protéines de décoration sont généralement absentes de la procapside29, nous nous attendons à ce que la cage DecP74-26 s’assemble de manière coopérative lors de l’expansion de la capside afin de la stabiliser. Des expériences futures interrogeront le rôle de la coopérativité dans l’assemblage et la stabilité.

Les améliorations architecturales dans le MCP P74-26 et le Dec fournissent une stabilisation contre la pression interne élevée. Comment les forces de la pression interne agissent-elles sur la capside, et comment l’architecture de la capside résiste-t-elle à ces contraintes ? Si nous supposons que la pression de l’ADN encapsulé est distribuée uniformément autour de la capside isométrique, alors tous les points de la capside subissent un vecteur de force perpendiculaire à la surface de la capside. Par analogie, la capside subit des forces similaires à celles d’un ballon. Ainsi, la pression interne provoque des contraintes latérales sur les interactions de la capside. Si la pression interne élevée exercée par le phage remet en cause la stabilité de la capside, elle peut permettre la mise en place de mécanismes de stabilité reposant sur la tenségrité. Il est possible que la pression interne puisse être exploitée pour produire une particule stabilisée par la contrainte sur les sous-unités individuelles. A l’appui de cette hypothèse, les capsides de picornavirus, qui sont confrontés à une pression interne considérablement moindre, peuvent être stabilisés par des modifications mineures de la capside53.

L’architecture de la capside de la P74-26 est construite pour résister à la contrainte latérale par l’intégrité tensionnelle. L’intégrité tensionnelle, ou tenségrité, est un mécanisme généralisé de stabilité architecturale qui implique des régions structurées maintenues ensemble par un réseau d’éléments flexibles qui sont sous tension continue54. Dans la capside P74-26, les domaines A et P sont les régions structurées, et les lassos et les bras étendus sont les éléments flexibles qui transmettent la tension. Par exemple, le lasso de la boucle E va se tendre contre le poteau d’attelage formé par la boucle G et le domaine P du voisin. De même, le bras N forme un lasso dont l’extrémité est maintenue en place par la boucle S qui se verrouille dans la rainure entre l’avant-bras et la main (Fig. 6c). Ainsi, nous prédisons que la boucle S présentera les caractéristiques d’une liaison d’accrochage, une liaison non covalente qui se renforce sous tension55. En outre, la capside de la P74-26 contient plusieurs volets qui s’imbriquent les uns dans les autres. Ces interactions résisteraient topologiquement aux contraintes latérales et longitudinales de la pression interne. Dans l’ensemble, ces éléments de lasso et de rabat utilisent la tension pour résister à la défaillance structurelle de la capside. Le mécanisme de tenségrité observé ici est simplement un exemple plus élaboré de la tenségrité de la capside suggérée par Caspar il y a de nombreuses années56.

Les interactions du lasso, du rabat et du bras sont positionnées de telle sorte que la pression interne distribue la contrainte sur plusieurs liaisons. Par exemple, le feuillet β de la boucle E subit des forces le long de l’axe du feuillet. Ainsi, toutes les liaisons qui maintiennent la feuille ensemble sont sous contrainte plutôt que la géométrie orthogonale dans laquelle la contrainte est juste sur les liaisons à l’extrémité de la feuille. La rupture de la capside nécessiterait la rupture simultanée de nombreuses liaisons (une géométrie de cisaillement), plutôt qu’une géométrie de dézippage dans laquelle les liaisons se rompent une à la fois57. Des études pionnières sur une seule molécule ont montré que la rupture d’une géométrie de cisaillement nécessite des forces beaucoup plus élevées que celles qui agissent dans une géométrie de dézippage58,59,60. Ainsi, la capside de la P74-26 est construite de telle sorte que les forces latérales agissent dans une géométrie de cisaillement, ce qui entraîne une grande tenségrité.

En plus de l’architecture stabilisatrice unique de la capside, la P74-26 adopte également un mécanisme non canonique pour modifier la capacité de la capside. La capside du P74-26 est plus grande que celle de la plupart des Caudovirus, ce qui est en corrélation avec son génome anormalement grand. La plupart des Caudovirus T = 7 ont une taille de génome comprise entre 30 et 50 kb (Tableau supplémentaire 2), alors que le génome du phage P74-26 est presque deux fois plus long, à 83 kb24. Sur la base de la taille du génome, nous avions prédit que la capside serait T = 12 (taille moyenne du génome ~80 kb61), bien que T = 9 ou T = 13 aurait été possible (taille moyenne du génome ~70 ou ~120 kb, respectivement). La capside de la P74-26 atteint cette taille supérieure en augmentant considérablement la taille du capsomère plutôt qu’en modifiant la complexité icosaédrique. Le capsomère est plus grand parce que le MCP de la P74-26 couvre plus de surface que la normale, malgré une longueur typique pour le MCP. Par conséquent, le capsomère est légèrement plus fin que la normale (Fig. 4b). Ainsi, le nombre de résidus dans le MCP ne prédit pas la surface totale couverte, et la taille du génome ne prédit pas le nombre de triangulations.

Récemment, Bayfield et al.62 ont déterminé la structure d’un phage thermophile étroitement apparenté T = 7, qui utilise de façon similaire des capsomères agrandis pour augmenter la capacité de la capside. À notre connaissance, il s’agit d’un mécanisme non canonique d’augmentation de la capacité de la capside. Il existe deux mécanismes classiques d’augmentation de la capside : (1) l’augmentation du nombre de triangulations et (2) la conversion d’une tête isométrique en tête prolate. Dans le premier cas, des hexons sont ajoutés sur toutes les faces de la capside, tandis que dans le second, des hexons sont ajoutés sur dix des faces icosaédriques de sorte que la capside est allongée dans une dimension (Fig. 9). Dans les deux cas, les capsomères restent de la même taille. Ici, nous avons identifié un troisième mécanisme d’évolution d’une capside plus grande : l’augmentation de la taille du capsomère.

Ces trois mécanismes ont des barrières évolutives très différentes. Les deux mécanismes classiques peuvent être mis en œuvre par des mutations simples et ont été observés de nombreuses fois. Dans de nombreux virus, des mutations ponctuelles simples modifient le nombre de triangulation5,63,64. En outre, le nombre de triangulation de certaines capside peut être modifié sans changer la séquence MCP3,65,66. De même, des mutations ponctuelles simples dans le phage T4 convertissent la capside de prolate à isométrique ou génèrent des têtes géantes dans lesquelles le grand axe de la tête prolate est allongé4,67. Par conséquent, les barrières évolutives pour modifier le volume de la capside par les deux mécanismes classiques semblent être assez faibles. En revanche, la stratégie de capsomère élargi identifiée ici nécessite des modifications multiples et importantes des séquences des protéines de la capside. La plus grande capside de la P74-26 nécessite d’importantes modifications des huit modifications distinctes de la structure MCP, ainsi que du bras Dec (figures 3a, b et 4c, d). Cela soulève la question suivante : pourquoi le phage P74-26 a-t-il utilisé cette stratégie évolutive apparemment plus difficile plutôt que les stratégies classiques plus faciles ? Quelles contraintes ont empêché l’évolution d’une capside plus grande par les voies classiques ?

Notre première hypothèse est que les lassos, les rabats et les bras qui stabilisent la capside P74-26 ont besoin d’un capsomer plus grand pour fonctionner. Il est possible que les lassos aient besoin d’un espace supplémentaire pour s’ouvrir suffisamment pour qu’une structure de poteau d’attelage puisse s’insérer. De même, les rabats et les bras peuvent avoir besoin d’une certaine longueur pour exercer leur activité stabilisatrice. Si c’est le cas, les éléments architecturaux qui stabilisent la capside nécessitent des capsomères plus grands que la normale. Dans ce scénario, le capsomère plus grand est la caractéristique structurelle sélectionnée et la géométrie T = 7 est un tympan : une structure biologique qui est un sous-produit de l’évolution plutôt que le résultat d’une sélection directe68. Cependant, nous ne sommes pas favorables à cette hypothèse parce que les lassos sont trouvés dans les herpèsvirus, dans lesquels le pli HK97 est une taille typique (les MCP des herpèsvirus ont plusieurs autres domaines de tour qui augmentent la taille, mais ces domaines ne font pas partie de l’étage principal de la capside et ne contribuent pas au pli HK9749). En outre, d’autres MCP de Caudovirus contiennent de longs bras N (par exemple, le phage Sf631) ou des boucles E qui sont ouvertes presque aussi largement que la P74-26 (par exemple, le phage P2243), mais ces protéines sont de taille typique. Néanmoins, cette hypothèse reste non testée.

Une deuxième hypothèse est que la taille du génome et la capacité de la capside ont coévolué par de petites augmentations concomitantes. Si le phage ancestral a évolué avec un génome légèrement plus grand que celui qui peut être logé dans la capside, alors il peut y avoir une pression sélective pour une capside légèrement plus grande. L’augmentation du nombre de T ou la transition vers une tête allongée augmente considérablement le volume de la capside, ce qui entraîne de fortes baisses de la pression interne. Ces transitions peuvent être découragées car la pression interne doit être maintenue pour l’infection26. Pour éviter de grands changements dans la pression interne, les capsomères plus grands peuvent lentement coévoluer avec un génome plus grand.

Notre dernière hypothèse est que la géométrie de la capside a un effet direct sur la stabilité globale de la capside. Nous supposons que la géométrie T = 7 est intrinsèquement plus stable que les nombres de triangulation plus élevés en raison des conformations variables des hexons. Toutes les capside qui sont T = 9 ou plus ont plus d’un type d’hexon présent, tandis que toutes les capside T ≤ 7 ont exactement un type d’hexon (sauf T = 1, qui n’a pas d’hexon69,70). Par exemple, T = 7 a une conformation d’hexon à plissement unique, tandis que T = 9 a à la fois des hexons ailés et plats (figures supplémentaires 11a, b). Nous notons également que les capside prolates ont plusieurs types d’hexons (généralement trois conformations d’hexons ou plus ; Fig. 9). Ainsi, les principales protéines de capside des virus T > 7 doivent s’accommoder de l’hétérogénéité conformationnelle des hexons, ce qui peut nuire à la stabilité.

Nous émettons l’hypothèse que la géométrie T = 7 est la plus haute complexité (c’est-à-dire la plus grande taille) qui est intrinsèquement stable. Des géométries plus complexes introduiraient une instabilité par la variation de la conformation de l’hexon. Cette instabilité inhérente peut nécessiter des mécanismes de stabilisation supplémentaires pour l’atténuer, comme des protéines de décoration pour cimenter la structure en place. Nous envisageons deux inconvénients non mutuellement exclusifs de la géométrie T > 7. Premièrement, chacune des conformations séparées de l’hexon doit rester fonctionnelle et stable, ce qui contraindrait l’évolution des protéines MCP pour une plus grande stabilité. Le second avantage est qu’un nombre de triangulation plus faible entraîne moins d’interfaces sous-unité-sous-unité, ce qui minimise le nombre de points faibles dans la capside. À l’appui de cette hypothèse, le virus archéen extrémophile HSTV-2 (Halorubrum sodomense tailed virus 2) emballe son génome de ~68 kb dans une tête T = 771. Le HSTV-2 utilise une capside plus grande que la normale et possède également des protéines de décoration trimériques qui se situent sur les axes triple/quasi-treple. Le fait que ce mécanisme d’élargissement de la capside n’ait été observé que chez les extrêmophiles appuie l’idée que la géométrie T = 7 a un effet bénéfique sur la stabilité. Pour appuyer davantage notre hypothèse, toutes les capsides T > 7 connues utilisent des protéines de décoration (à notre connaissance), alors que de nombreux virus T = 7 n’ont pas de protéines de décoration.

Si divers nombres de triangulation ont une stabilité inhérente différente, cela suggérerait que chaque géométrie présente des points faibles à différentes régions de la capside, comme cela a été prédit par des travaux théoriques72. Nous supposons que les axes triples/quasi-triples représentent les points faibles dans un réseau T = 7. À l’appui de cette hypothèse, les protéines de décoration des Caudovirus T = 7 se trouvent généralement sur les axes triples/quasi triples (tableau supplémentaire 2)29,44,52. De plus, ces axes sont stabilisés par des liaisons transversales covalentes dans le phage HK9745 et des volets de boucle en T dans la P74-26 (Fig. 7b). Pour examiner cette idée plus en profondeur, nous notons que le phage T = 9 utilise également des protéines de décoration au niveau des axes triples73,74, tandis que le phage T = 12 et T = 13 utilise des protéines de décoration au niveau des centres des capsomères61,75,76.

Nous notons que toute notre analyse a principalement porté sur les Caudovirus. Ces virus ne décomposent généralement pas leurs capsides dans le cadre de leur cycle de vie, de sorte que la capside n’a pas de pression sélective pour être labile. En fait, la pression élevée de l’ADN empaqueté présente une pression sélective élevée pour développer des capsides stables. Il est probable que d’autres types de virus utilisent des mécanismes de stabilité différents, en particulier les virus qui désassemblent leurs capsides comme une partie nécessaire de leur cycle de vie.