3.1.2 Azidok
Azidokat az egyik legalkalmasabb csoportnak tartják bioortogonális reakciókhoz és kattintáskémiai célokra. A ketonokkal és az aldehidekkel ellentétben az azidok alig fordulnak elő biológiai rendszerekben. Az azidok nagy saját energiával rendelkeznek, de nincs természetes reakciópartnerük (King és Wagner, 2014), kis méretűek és semleges össztöltéssel rendelkeznek, és végül fiziológiás körülmények között kinetikailag stabilak.
A Staudinger-ligáció (Staudinger és Hauser, 1921) jó jelöltnek tűnik az azidokat alkalmazó biokonjugációs reakciókhoz. Ebben a reakcióban az azidok elektrofil csapdát tartalmazó trifenilfoszfin-reagensekkel reagálva egy aza-ilid intermedier keletkezik, amely az elektrofil észter-karbonilcsoporttal reagálva egy öttagú gyűrűt képez, amely hidrolízisnek megy keresztül a végső stabil amidkötés létrehozásához (5.6A ábra) (Steen Redeker és mtsai., 2013; Staudinger és Hauser, 1921). Ennek a reakciónak egy új változatát írták le nem sokkal később (King és Wagner, 2014; Saxon és Bertozzi, 2000; Saxon és mtsai., 2000; Nilsson és mtsai., 2000), amelyet “nyomvonal nélküli Staudinger-ligációnak” neveznek, ahol a végső amidkötésű termék a foszfinoxid-részből szabadul fel.
5.6. ábra. Példák azidokkal végzett biokonjugációs reakciókra. (A) Staudinger-ligáció; (B) rézkatalizált azid-alkin cikloaddíció; (C) törzs által támogatott azid-alkin cikloaddíció; (D) cikloaddíció oxanorbornadiénekkel. UAA, természetellenes aminosavak.
A Staudinger-ligációt számos alkalmazásban alkalmazták. Raines és munkatársai például ezt a reakciót az NCL ciszteinmentes alternatívájaként alkalmazták peptidligáláshoz (Nilsson és munkatársai, 2001), illetve NCL-lel kombinálva mesterséges RNAáz A összeállításában (Nilsson és munkatársai, 2005). Emellett más alkalmazásokban is alkalmazták, mint például fehérjék immobilizálása szilárd hordozón in vitro és in vivo képalkotáshoz (Saxon és Bertozzi, 2000; Prescher et al., 2004), biomolekulák in vitro és in vivo jelölése (Saxon és Bertozzi, 2000; Prescher et al., 2004; Vocadlo et al., 2003), fehérjék dúsítása (Vocadlo et al., 2003) és kimutatása (Charron et al., 2009), valamint (Lemieux et al., 2003) fehérjemódosítása.
A Staudinger-ligációnak mindazonáltal vannak hátrányai. Nevezetesen a lassú kinetikája (másodrendű sebességi állandó az alacsony 10-3 M-1s-1 tartományban) (Lin et al., 2005), a foszfinvegyületek oxidációs labilitása (viszonylag nagy koncentrációjú foszfinreagenst kell használni), valamint a foszfinok esetleges keresztreaktivitása a diszulfidokkal (Lang és Chin, 2014; King és Wagner, 2014).
Azidok reagálhatnak alkénekkel Cu(I)-katalizált azid-alkin cikloaddíció (CuAAC) vagy 1,3-dipoláris cikloaddíció (5.6B ábra) során, amely a kattintáskémiai reakciók egyik legelterjedtebb példája (Rostovtsev et al., 2002; Tornøe et al., 2002). Ez a reakció nagy érdeklődést mutat a biológiai tudományokban a jó szelektivitás, a nagy hozam és az enyhe reakciókörülmények (szobahőmérsékleten, különböző oldószerekben) miatt. Emellett mind az azidok, mind az alkinek fehérjékbe történő bevitele a fehérjék szerkezetének és funkciójának befolyásolása nélkül lehetséges (Steen Redeker et al., 2013). Az azid és az alkin fiziológiás körülmények között, Cu(I) jelenlétében nagyon gyorsan képes stabil 1,2,3-triazol kötést képezni. A Sharpless és munkatársai által javasolt mechanizmus (Rostovtsev et al., 2002) először a terminális alkin rézacetilidbe történő bevezetését, majd az azid ezt követő támadását írja le (King és Wagner, 2014). A közelmúltban ezt a mechanizmust tovább finomították, és egy dikopréz intermediert javasoltak (Worrell és mtsai., 2013). A reakció legfőbb hátrányai a Cu(I)-függő mellékreakciók és a Cu(I) citotoxicitás (Baskin és mtsai., 2007; Plass és mtsai., 2011), amelyek miatt alkalmazása elsősorban az extracelluláris térben történő jelölésre korlátozódott (King és Wagner, 2014). A CuAAC-ot széles körben használták számos különböző biológiai vizsgálatban, például foszfolipidek jelölésére azok képalkotásához in vivo (Jao et al., 2009) és in vitro (Neef és Schultz, 2009), vírusok felszíni átalakítására (Steinmetz et al., 2009), fehérjék in vitro és in vivo módosítására/jelölésére (Link és Tirrell, 2003; Ngo és Tirrell, 2011; Liu és Schultz, 2010; Deiters és mtsai., 2003), nukleinsavak jelölésére (Weisbrod és Marx, 2008), valamint affinitás alapú szondaprofilozásra (Speers és mtsai., 2003).
A réz citotoxicitásának leküzdésére különböző megközelítéseket dolgoztak ki. Nevezetesen a vízben oldódó ligandumok alkalmazása a Cu(I)-koordinációhoz, a rézkeletizáló szerves azidok alkalmazása és a gyűrűtörzs bevezetése az alkin-részbe. Az első esetben a vízoldható ligandumok a Cu(I)-t koordinálva olyan aktivált rézkatalizátort képeznek, amely alacsony mikromoláris fémkoncentrációknál képes elősegíteni a CuAAC-ot, csökkentve ezzel egyidejűleg a Cu(I) potenciális toxicitását (Besanceney-Webler és mtsai., 2011; Del Amo és Wang, 2010; Hong és mtsai., 2009; Kennedy és mtsai., 2011). A második esetben az effektív Cu(I)-koncentrációt növelik a reakcióhelyen a belső réz-kelátképző részt tartalmazó azid ligandumok alkalmazásával (Brotherton és mtsai., 2009; Kuang és mtsai., 2010; Uttamapinant és mtsai., 2012). Az utolsó stratégiában olyan alkineket használnak, amelyeket aktiváltak, hogy katalizátor hiányában jobb kinetikával reagáljanak. Ebben a tekintetben a ciklooktin-részek alkalmazása növeli a reaktivitást a gyűrűk felszabadulása következtében (Steen Redeker et al., 2013; Baskin et al., 2007; Plass et al., 2011). A törzzsel támogatott azid-alkin-cikloaddíció (SPAAC) (5.6C ábra) nemcsak a fehérjék és antitestek jelölésére, hanem más alkalmazások, például az antitestmentes Western Blot-analízis (Boutureira és mtsai., 2015) számára is hatékony eszközzé vált, mivel nincs szükség további reagensekre vagy toxikus fémekre, amelyek károsíthatják a biomolekulákat. Bertozzi és munkatársai például bizonyították alkalmazhatóságát tisztított fehérjék módosítására (Baskin et al., 2007). További kísérletek során a reakciót sikeresen alkalmazták in vitro fibroblaszt sejteken (Baskin et al., 2007). Továbbá a SPAAC-ot élő egerekben lévő tumorok képalkotására használták nanorészecskék (Koo et al., 2012) és 18F PET segítségével, ahol a fluort azidhoz és cikloalkinhez is kötötték (Jeon et al., 2012). További alkalmazási területeket találtak a vírusmódosításban és a DNS-jelölésben (Qiu et al., 2013). A ciklooktinok összetett szintézise és az a tény azonban, hogy megnövekedett terjedelmük és hidrofobicitásuk befolyásolhatja a fehérjék szerkezetét és stabilitását (Kim et al., 2013), valamint fokozott aktiválásuk elősegítheti a természetben előforduló tiolokkal való mellékreakciókat, hátrányosnak tekinthetők.
Az elektronhiányos szulfonil-azidok aktivált alkénekkel (oxanorbornadiénekkel vagy norborénekkel) is reagálhatnak fémmentes cikloaddícióban (5.6D ábra), hasonlóan a SPAAC-hoz (Alder, 1930; Huisgen et al., 1980). Az azid-alkén cikloaddíciók terméke azonban egy viszonylag instabil triazolin, ellentétben a klasszikus click-cikloaddícióban keletkező aromás triazolokkal. Egy olyan oxanorbornadiént, amely egyszerre feszített és elektronhiányos, használtak dipolarofilként azidokkal való reakcióban (van Berkel és mtsai., 2008). Ebben az esetben az oxanorbornadién feszített kettős kötése azidokkal reagálva köztes triazolint képez, amely spontán retro Diels-Alder-reakción megy keresztül, furán felszabadulásával, ami stabil 1,2,3- vagy 1,4,5-triazolokhoz vezet. Ezt a reakciót egy oxanorbornadién-funkcionalizált fehérje és egy aziddal módosított ciklikus peptid szelektív biokonjugációjára használták fel vizes pufferekben. Bár az oxanorbornadiéneket könnyebb szintetizálni, mint ciklooktin társaikat, ez a cikloaddíciós reakció meglehetősen lassú és nem teljesen kemoszelektív a fehérjékben található más funkciós csoportokkal szemben, ami korlátozhatta széles körű alkalmazását (Lang és Chin, 2014; van Berkel és mtsai., 2008).