1 BEVEZETÉS
A foszfolipid kettősrétegű membránok (BLM) hasznos modellrendszert jelentenek a biológiai sejtmembránok lipid kettősrétegű összetevőinek alapvető aspektusainak vizsgálatára, és különösen rugalmas tulajdonságaik vizsgálatára. Ezek az amfipatikus molekulák önszerveződő struktúrái, amelyek fizikai jellemzői szorosan hasonlítanak a szmektikus folyadékkristályokéhoz . A lipid kettősréteg mátrix képes hidrofób és amfipatikus molekulák, például fehérjék, más lipidek, peptidek, szteroidok és kozurfaktánsok beépítésére. A folytonos közegnek tekintett lipidmembránok rugalmas tulajdonságait számos tanulmányban használták fel, a helyi jelenségektől kezdve, mint a lipid-lipid , lipid-fehérje és fehérje-fehérje kölcsönhatások , az egész sejtek alaki ingadozásáig. Ezenkívül a kettősréteg folyékony szénhidrogén jellegét a foszfolipidek közötti nanoszkopikus méretű molekulák közötti kölcsönhatások tartják fenn: a poláris fejcsoportok közötti elektrosztatikus és dipólus-dipólus kölcsönhatások , a vízmolekulák által közvetített kölcsönhatások és a szénhidrogénláncok közötti van der Waals diszperziós kölcsönhatások .
A BLM felszínei nem tökéletesen sík és nem merevek . A BLM rendszer egy kvázi kétdimenziós rugalmas szerkezet , amely folyamatosan különböző konformációs és dinamikai átmeneteken megy keresztül . Továbbá a mesterséges és természetes BLM-ek nem szigetelő rendszerek, hanem áteresztőek a víz és az elektrolitok számára, amelyek a transzmembrán pórusok sokféleségén keresztül diffundálnak át.
A sztochasztikus transzmembrán pórusokat a következő mechanizmusok valamelyike hozza létre: véletlenszerű és elfogult termikus fluktuációk (termoporáció) és elektromos kiváltás (elektroporáció). A BLM-en belüli lipidmolekulák a véletlenszerű termikus mozgások három különböző kategóriáját követik: a kettősréteg felszínével párhuzamos laterális transzlációkat, a 10-7 m2s-1 (Dl) nagyságrendű laterális diffúziós együtthatóval, a kettősréteg felszínére merőlegesen a lipidtengelyek körüli oszcillációkat és rotációkat .
A véletlenszerű irányú laterális transzlációk a kettősréteg felszínén a lipidek poláris fejcsoportjainak sűrűségének helyi fluktuációit idézik elő. Ezért a kettősréteg felületének pillanatfelvétele nanoszkopikus méretű, nagyobb sűrűségű poláris fejcsoportokkal rendelkező helyi tartományokat (azaz klasztereket), valamint kisebb sűrűségű zónákat mutat. A BLM bizonyos fizikai feltételei (pH, hőmérséklet, lipidkomponensek, elektrokémiai potenciál stb.) esetén az utóbbi zónák a membrán kis helyi hibáit (azaz üresedéseit) jelentik. Ezekben a tartományokban a vízmolekulák behatolhatnak a kettősréteg hidrofób mátrixába. Tekintsük azt az esetet, amikor minden monorétegből két független hiba van, amelyek a membránfelületen egymásra merőleges irányban helyezkednek el. Ezek egy henger alakú hidrofób pórust hozhatnak létre, amelynek belső felületét a lipidek hidrofób láncai szegélyezik. Ezért az ilyen típusú átmeneti pórusok hidrofób jellegűek. Az is lehetséges, hogy a hidrofób pórus közelében elhelyezkedő poláris fejcsoportok a pórus belseje felé irányuló forgásoknak engedelmeskednek. Ebben az esetben a pórusok belső hidrofób felülete poláros fejcsoportokkal lesz bevonva. Így ezek a pórusok hidrofil jellegűek, már nem hengeres geometriájúak és stabilabbak, mint a hidrofób pórusok . Más szóval a BLM két monorétegében a poláris fejcsoportok sűrűségének véletlenszerű termikus fluktuációja képes sztochasztikus transzmembrán pórusokat létrehozni.
A hidrofób vastagság fluktuáció jelenlétét a BLM belsejében elméletileg és kísérletileg is kimutatták. Ezt a kétrétegvastagság (h) értékeinek meghatározásával értük el három független eljárásból: elektromos kapacitásmérések (hc) , optikai reflexiós mérések (hr) és közvetlen számítás (hav) alapján. Tanford (1980) a következő képlet segítségével számította ki a kettősréteg vastagságát: hav = Nl M/ρ, ahol Nl, M és ρ az egységnyi területre jutó lipidek száma, a hidrofób láncok molekulatömege és a hidrofób zóna sűrűsége. A hidrofób területek “vastagságingadozása” miatt hc-nek egyenlőnek kell lennie hav-val, míg ebben az esetben mindkettőnek a poláros réteg vastagságával (htp) kisebbnek kell lennie hr-nél: hc ≅ hav = hr-htp. Ha a lipid kettősréteg egyenletes vastagságú lenne, akkor hc-nek egyenlőnek kell lennie hav-val. A lipidek bináris keverékéből álló BLM esetében a foszfolipiddomének megjelenését követően a foszfolipidek között szelektív asszociáció megy végbe. Vastagságuk a lipidkomponensek szénhidrogénláncának hosszától függ. Popescu és munkatársai (1991) kimutatták a sztochasztikus pórusok megjelenését a BLM-ekben a kettősréteg vastagságának ingadozása miatt. Az ilyen mechanizmust követő membránperforáció energiahatárának magassága azonban nagy (kb. 91 kT, ahol k és T a Boltzmann-állandó, illetve az abszolút hőmérséklet). Ebben az esetben a pórus geometriai profilja elliptikus toroid alakú. Azt is kimutatták, hogy egy ilyen transzmembrán pórus stabil állapotba fejlődhet . Az ezzel a modellel kapott eredmények meglehetősen meglepőek voltak, mivel a membránokban a statisztikai pórusok záródása gyors időskálán történik. Két évvel később Zhelev és Needham (1993) nagy, kvázistabil pórusokat hozott létre lipid kettősrétegű vezikulákban, így tartva magát a korábbi modell előrejelzéséhez . Moroz és Nelson (1997) kiszámította a membrán szakadással szembeni ellenállását egy vonalfeszültségben kifejezve egy nagy pórusra a kétrétegű vezikulákban .
Stochasztikus transzmembrán pórusok is kialakulhatnak a lipidek elfogult termikus mozgásával . Ezt a mechanizmust néha termoporációnak nevezik. A pórusok egy termikusan indukált aktivációs folyamat révén jelennek meg a membránban. Alternatív megoldásként a pórusképződés aktiválási folyamata külső elektromos térrel is előidézhető (más néven elektroporáció) . Az elektroporációval létrehozott pórus nagyobb és stabilabb . Az elektroporációs mechanizmust javasolták gyógyszerek és gének sejtekbe és szövetekbe juttatására .
A transzmembránfehérje pórusokat fehérjerendszerek alkotják, amelyek a kis peptidcsatornáktól (pl. gramicidin, alamethicin, melittin stb.) a nagy fehérje multimerikusan összeállított csatornákig széles skálát fednek le. Mivel ezek a pórusok nagyok és vízzel töltöttek, a hidrofil anyagok, beleértve az ionokat is, át tudnak rajtuk diffundálni, így a membrán elektromos potenciálját eloszlatják. A transzmembrán fehérjepórusok két fő szerkezeti osztályba tartozó integrálfehérjékből állnak: (1) a kötegelt transzmembrán a-hélix szerkezetek által alkotott szelektív csatornák és (2) a monomer (pl. OmpG), dimer (pl. szelektív Cl-csatornák), trimer (pl. OmpF) vagy multimer transzmembrán ß-hordó szerkezetek (pl. α-hemolizin, leukocidinek, citolizinek) által alkotott szelektív csatornák, pórusok és pórusok . A lipid kettősréteg in vitro rendszerként használható ezeknek a fehérjecsatornáknak a tanulmányozására, ha funkcionális membránná rekonstruálják őket . Ezenkívül a BLM-ek eszközként használhatók a membránfehérje-technológia és annak alkalmazásai akár az egymolekulás biofizikában, akár a biotechnológiai területen .
Egy másik példában a colicin Ia, egy Escherichia coli által szekretált fehérje feszültségkapcsolt ioncsatornákat képez mind a célbaktériumok belső membránjában, mind a síkbeli BLM-ekben . A colicin Ia egy membrántranszporter, amely a bakteriális toxinok azon osztályába tartozik, amelyeknek ugyanaz a stratégiájuk: beilleszkednek a többi tápanyaggal versengő baktérium membránjába, és így nagyméretű pórusokat hoznak létre. Ennek megfelelően ezek a pórusok károsítják az elektrokémiai membránpotenciált, és végül ezeknek a konkurens baktériumoknak a pusztulását idézik elő. A fent említett sztochasztikus pórusokhoz képest a fehérjepórusok kialakulásának mechanizmusa és tulajdonságai is eltérőek. Míg egy sztochasztikus pórus “elfelejti” keletkezési mechanizmusát, a transzmembrán fehérjepórusok némelyike (pl. a colicin Ia) úgy tűnik, hogy “emlékező” hatást mutat, legalábbis a BLM elektromos stimulációjához használt impulzusok meghatározott szekvenciájának hatására .
Genetikus pórusokkal találkoztunk az emlősök májából származó szinuszos erek falában. Ezeknek az ereknek az endotélsejtjei számos szitalemezes pórust tartalmaznak . Ezek a körülbelül 0,1 μm átmérőjű pórusok lehetővé teszik, hogy a vérplazma és a chilomikronok egy része a sinusoidális térből a Disse térbe jusson. Ezért az endotél pórusai szabályozzák a folyadékok, oldott anyagok és részecskék cseréjét a sinusoidális vér és a Disse tér között .
Ebben a munkában a folytonos közegek rugalmassági elméletét használtuk a sztochasztikus pórusok megjelenésének leírására a síkbeli BLM-eken keresztül.