Free Press

A P74-26 Major Capsid Protein egyedi architekturális jellemzőket – lasszókat, gyűrűket és lebenyeket – használ a kapszid stabilitásának fokozására. Fokozott hidrofób kölcsönhatásokat figyelhetünk meg az alegység-alegység határfelületeken a kapszidon belül. A hidrofób kölcsönhatások becslések szerint >2-szer nagyobbak a P74-26 esetében, mint más mezofil homológok esetében (3. és 4. kiegészítő táblázat). Ez a megfigyelés részben magyarázatot adhat a P74-26 kapszid fokozott termosztabilitására, mivel a hidrofób hatás erőssége magas hőmérsékleten növekszik32. Ezzel szemben nem tapasztaltunk jelentős változást a hidrogénkötések vagy sóhidak számában (Kiegészítő 3. és 4. táblázat), más olyan kölcsönhatásokban, amelyek egyes globuláris fehérjék esetében hőstabilitást biztosítanak33,34,35,36.

Nem voltunk különösebben meglepve, hogy a P74-26 kapszidban fokozott hidrofób kölcsönhatásokat találtunk. A termofil globuláris fehérjékkel végzett számos tanulmány szerint a fokozott hidrofób erők a termikus stabilitás egyik fő tényezője33,37,38,38,39,40. A P74-26 kapszidot azonban két dolog teszi egyedülálló modellrendszerré: (1) a szorosan csomagolt DNS nagy belső nyomása mechanikai feszültséget indukál a kapszidban7,8,27 és (2) ez egy önösszeszerződő szerkezet, amelyben az alegységek közötti architektúra és topológia fontos szerepet játszik az általános stabilitásban. Ezeket az elveket a P74-26 szerkezetét számos mezofil homológ szerkezetével összehasonlítva tudjuk levezetni.

Megállapítottuk, hogy a P74-26 kapszidját számos hurok és nyúlvány stabilizálja, amelyek topológiai kapcsolatokat alkotnak az alegységek között. Az egyedi E-hurok lasszó egy szomszédos MCP G-hurokjához és P-doménjéhez csatlakozik, amelyek a lasszó topológiai kikötésénél kapaszkodóként működnek. Továbbá az N- és C-karok a Dec-karral együtt teljesen körbeveszik az E-loop β-szálait, ami egy másik, a P74-26-ra jellemző építészeti elem (5e. ábra). Így az E-loop az alap felé gyűrűzött, a csúcs felé pedig lasszót alkot.

A második lasszót az N-kar alkotja, amely mind a kapszomeren belüli, mind a kapszomerek közötti kölcsönhatásokat kialakítja. Az N-kar egy kapszomeren belül egy szomszédos MCP E-loopjához kötődik a felső karszálon, az alkar spirálon és a kéz régióján keresztül (5a, c ábra). Továbbá a könyök, az alkar és a kéz stabilizálja a kapszomer-kapszomer kölcsönhatásokat a DecP74-26 és egy olyan MCP alegységgel való kötődés révén, amely a kétszeres/kvázi-kétszeres tengelyen fekszik (6a, b ábra). Bár az N-kar technikailag nem zárt hurok, a P74-26 hatékonyan lezárja a hurkot az egyedi S-hurok segítségével, hogy rögzítse az alkar és a kéz régióinak helyzetét (6c. ábra). A mezofil Caudovírusokban31,41,42,43,44,45,46 nem találunk hasonló N-karú lasszó architektúrát31,41,42,43,44,45,46, ami arra utal, hogy ez az architektúra fontos a kapszid stabilitásának fokozásában.

Noha más Caudovírusokban nem találunk lasszókat, a távolabbi rokon herpeszvírusok analóg lasszó architektúrát tartalmaznak a HK97 hajtás N-karjában47,48,49. A P74-26 N-karjához hasonlóan a herpeszvírusok N-karjának lasszói sem valódi zárt hurkok. E látszólagos hasonlóság ellenére a herpeszvírus lassók másképp működnek. Kizárólag a kapszomerek közötti kölcsönhatásokat stabilizálják, míg a P74-26 N-karú lasszója mind a kapszomeren belüli, mind a kapszomerek közötti kölcsönhatásokat stabilizálja. Ráadásul a herpeszvírus-kapszidok pentonjai nem mutatnak lasso-kölcsönhatásokat, és a kölcsönhatások a hexon alegységeken belül is változóak, míg a P74-26 esetében a pentonokban és a hexonokban is közel azonos lasso-kölcsönhatások vannak. Ezek a megfigyelések azt jelzik, hogy a lasso-architektúra valószínűleg egymástól függetlenül fejlődött ki, és rávilágítanak a topológiai stabilizációs mechanizmusok rugalmasságára. Feltételezzük, hogy a meghosszabbítható kararchitektúra megkönnyíti az erősebb kölcsönhatások evolúcióját az önösszeszerződő rendszerekben, például a kapszidokban. Ezek a nyitott végű hurkok könnyen fokozhatók sorozatos, egy-egy reziduumos hosszabbítással. Talán ez a könnyű evolúció az oka annak, hogy mind a P74-26, mind a herpeszvírusokban megtalálhatók a kiterjesztett karú lászók. Ezek a meghosszabbított lassók hasonlóak az N- és C-terminális kiterjesztésekhez, amelyek más vírusoknál az összeszerelést közvetítik (pl. C-terminális kiterjesztések az SV40 kapszid köpenyfehérjéiben50). Arra számítunk, hogy az ilyen típusú kiterjesztett lassók hasznosak lehetnek a stabilabb kapszidok és más önösszeszerződő részecskék tervezésében.

A lasso-architektúra másik előnye, hogy kevésbé kiterjesztett konformációt is felvehet. A P74-26 MCP két lasszót tartalmaz a HK97 hajtás két végén, amelyek közül feltehetően mindkettő jelen van a jóval kisebb prokapszidban is. Ezeknek a lasszó struktúráknak a használatával a P74-26 megőrizheti nagyfokú stabilitását, miközben konformációs rugalmasságot biztosít az érés során történő bővüléshez. Feltételezésünk szerint a lasszók a prokapszidban kevésbé kiterjedtek; a kapszid terjeszkedésekor a lasszók elérik teljes kiterjedésüket, ahol rögzülnek a helyükön. Az érett kapszidban megfigyelt teljes kiterjedés biztosítja a feszültségi integritást, amint azt alább tárgyaljuk.

A P74-26 egymásba fonódó lebenyeket használ a kapszomerek közötti kapcsolatok topológiai stabilizálására. A T-hurok a szomszédos kapszomerben lévő MCP alegység P-domainján lévő barázdába való beilleszkedéssel stabilizálja a kapszomerek közötti kölcsönhatásokat. Ezek a T-hurok kölcsönhatások a kapszid belső oldala mentén a háromszoros/négyszeres-háromszoros tengelyek mentén találhatók (7b. ábra; 7b. kiegészítő ábra). Hasonlóképpen, a kapszid külső oldalán a kapszidok közötti kétszeres/kvázi-kétszeres kölcsönhatásokat az N-karok egymásba ágyazott elrendezése stabilizálja (7c. ábra; 7a. kiegészítő ábra). Ezek az egymást átfedő struktúrák hasonlítanak a mozgó doboz tetején lévő csappantyúk egymásba illesztett elrendeződésére. Ily módon a kapszid külső és belső oldalait két különálló, egymásba fonódó lebeny kölcsönhatása stabilizálja. Azt javasoljuk, hogy a szimmetriatengelyeken és kvázi szimmetriatengelyeken megfigyelhető mozgó doboz elrendezések nagymértékben megerősítik a kapszidot a belső nyomással szemben, mivel topológiailag kihívást jelentenek a megszakításukkal szemben. Ezek az elrendezések azonban feltehetően az összerakás szempontjából is kihívást jelentenek, ami felveti azt a fontos kérdést, hogy a P74-26 kapszid hogyan rakódik össze az interleaved architektúrával.

A P74-26 Decoration fehérje szintén egyedi szerkezeti elrendezést vesz fel, ami jelentősen hozzájárul a kapszid termosztabilitásához. A dekorációs fehérjék növelik a kapszid stabilitását28,29,51, bár további szerepeket is feltételeztek52. A háromszoros/négyszeres-háromszoros tengelyeket a DecP74-26 trimer stabilizálja. A mezofil Caudovírusokhoz képest a DecP74-26 trimer sokkal nagyobb kölcsönhatási területen több alegységgel lép kölcsönhatásba (8a. ábra). Az egy DecP74-26 alegységre jutó teljes kölcsönhatási terület igen figyelemre méltó: ~4100;Å2 egy 146 maradékból álló fehérje esetében. Korábbi tanulmányunk kimutatta, hogy a DecP74-26 lényegesen stabilabb, mint mezofil homológjai, és ez a stabilizáció elsősorban egy rendkívül szoros trimer23 kialakításán keresztül valósul meg. A trimerizációs kölcsönhatások azonban a teljes DecP74-26 kölcsönhatási területnek csak kis hányadát teszik ki (a teljes kölcsönhatási terület ~18%-át DecP74-26 alegységenként). Ez arra utal, hogy a DecP74-26 és a kapszid közötti kölcsönhatás jelentős mértékben járul hozzá a stabilitáshoz.

A DecP74-26 trimerek közötti kölcsönhatások a kapszidot összetartó ketrecet alkotnak (8b. ábra). Ez az elrendeződés egyedülálló a P74-26-ra. Például a lambda és a TW1 fágok nagyon hasonló Dec-protein hajtást használnak23, de a Dec-karjuk kölcsönhatása más kapszidfehérjékkel sokkal korlátozottabb29,44. Továbbá, az L fág nem kapcsolódó dekorációs fehérjéje nem kapcsolódik a szomszédos trimerekhez, sőt, a kvázi-háromszoros tengelyeknél hiányzik52. A T4-fágot a Soc fehérje díszíti, amely kölcsönhatásba lép a szomszédos Soc alegységekkel a hármas és kvázi-hármas tengelyeken; azonban a Soc viszonylag alacsony foglaltságban van jelen (~50%), így a ketrec nem teljes41. Mivel a díszítőfehérjék általában hiányoznak a prokapszidból29, arra számítunk, hogy a DecP74-26 ketrec a kapszid terjeszkedésekor kooperatív módon áll össze, hogy stabilizálja a kapszidot. A jövőbeni kísérletek a kooperativitásnak az összeszerelésben és a stabilitásban betöltött szerepét fogják firtatni.

A P74-26 MCP és Dec architekturális javításai stabilizációt biztosítanak a nagy belső nyomással szemben. Hogyan hatnak a belső nyomásból származó erők a kapszidra, és hogyan áll ellen a kapszid architektúra ezeknek a feszültségeknek? Ha feltételezzük, hogy a kapszulázott DNS nyomása egyenletesen oszlik el az izometrikus kapszid körül, akkor a kapszid minden pontján olyan erővektor hat, amely merőleges a kapszid felületére. Analógia szerint a kapszidra olyan erők hatnak, mint egy léggömbre. Így a belső nyomás oldalirányú feszültségeket okoz a kapszid kölcsönhatásain. Bár a fág által kifejtett nagy belső nyomás megkérdőjelezi a kapszid stabilitását, lehetővé teheti a tensegrityre támaszkodó stabilitási mechanizmusokat. Lehetséges, hogy a belső nyomás kihasználható egy olyan részecske előállítására, amelyet az egyes alegységekre ható feszültség stabilizál. Ezt alátámasztandó, a pikornavírus-kapszidok, amelyek lényegesen kisebb belső nyomással küzdenek, a kapszid kisebb módosításával stabilizálhatók53.

A P74-26 kapszid architektúrája úgy épül fel, hogy a tenzionális integritás révén ellenálljon az oldalirányú feszültségnek. A tenziós integritás vagy tensegrity az architekturális stabilitás általánosított mechanizmusa, amely olyan strukturált régiókat foglal magában, amelyeket rugalmas elemek hálózata tart össze, amelyek folyamatos feszültség alatt állnak54. A P74-26 kapszidban az A- és P-domének a strukturált régiók, a lasszók és a meghosszabbított karok pedig a rugalmas elemek, amelyek a feszültséget továbbítják. Például az E-hurok lasszó megfeszül a G-hurok és a szomszédos P-domén által alkotott csatolóoszlophoz képest. Hasonlóképpen, az N-kar egy lasszót alkot, amelynek végét az S-hurok tartja a helyén, amely az alkar és a kéz közötti horonyba záródik (6c. ábra). Így azt jósoljuk, hogy az S-hurok a fogókötés jellegzetességeit mutatja, egy olyan nem kovalens kötését, amely feszültség hatására erősödik55. Továbbá a P74-26 kapszidja több, egymással összekapcsolódó lebenyt tartalmaz. Ezek a kölcsönhatások topológiailag ellenállnának a belső nyomás okozta oldal- és hosszirányú feszültségeknek. Összességében ezek a lasszó- és lebenyelemek a feszültséget használják fel a kapszid szerkezeti tönkremenetelének ellenállására. Az itt megfigyelt tensegrity mechanizmus egyszerűen a Caspar által sok évvel ezelőtt javasolt kapszid tensegrity egy kidolgozottabb példája56.

A lasszó, a lebeny és a karok kölcsönhatásai úgy helyezkednek el, hogy a belső nyomás a feszültséget több kötésen osztja el. Például az E-hurok β-lapja a lap tengelye mentén tapasztal erőhatásokat. Így a lapot összetartó összes kötés feszültség alatt áll, nem pedig az ortogonális geometria, amelyben a feszültség csak a lap végén lévő kötéseket terheli. A kapszid tönkremeneteléhez sok kötés egyidejű felszakadására lenne szükség (nyíró geometria), nem pedig egy felnyíló geometriára, amelyben a kötések egyenként szakadnak fel57. Úttörő egymolekulás vizsgálatok kimutatták, hogy a nyíró geometria sokkal nagyobb erőket igényel a felszakadáshoz, mint amikor az erők szétnyíló geometriában hatnak58,59,60 . Így a P74-26 kapszidja úgy épül fel, hogy az oldalirányú erők nyíró geometriában hatnak, ami nagyfokú feszítőszilárdságot eredményez.

A kapszid egyedi stabilizáló architektúráján kívül a P74-26 a kapszid kapacitásának megváltoztatására egy nem-kanonikus mechanizmust is alkalmaz. A P74-26 kapszidja nagyobb, mint a legtöbb Caudovírusé, ami korrelál a rendellenesen nagy genommal. A legtöbb T = 7 Caudovírus genomjának mérete 30 és 50 kb között van (2. kiegészítő táblázat), míg a P74-26 fág genomja közel kétszer olyan hosszú, 83 kb24. A genomméret alapján azt jósoltuk, hogy a kapszid T = 12 (átlagos genomméret ~80 kb61), bár lehetséges lett volna T = 9 vagy T = 13 is (átlagos genomméret ~70, illetve ~120 kb). A P74-26 kapszid ezt a nagyobb méretet a kapszomer méretének jelentős növelésével éri el, nem pedig az ikozaéderes komplexitás megváltoztatásával. A kapszomer azért nagyobb, mert a P74-26 MCP a normálisnál nagyobb felületet fed le, az MCP-re jellemző hossz ellenére. Következésképpen a kapszomer kissé vékonyabb a normálisnál (4b. ábra). Így az MCP-ben lévő maradékok száma nem jelzi előre a teljes lefedett területet, és a genom mérete nem jelzi előre a háromszögszámot.

A közelmúltban Bayfield és munkatársai62 meghatározták egy közeli rokon T = 7 termofil fág szerkezetét, amely hasonlóan megnagyobbított kapszomereket használ a kapszidkapacitás növelésére. Tudomásunk szerint ez egy nem kanonikus mechanizmus a kapszidkapacitás növelésére. A kapszid megnagyobbításának két klasszikus mechanizmusa van: (1) a triangulációs szám növelése és (2) az izometrikus fej prolatív fejre történő átalakítása. Az első esetben a kapszid minden felületén hexonokat adunk hozzá, míg a második esetben tíz ikozaéderes felületén adunk hozzá hexonokat úgy, hogy a kapszid egy dimenzióban megnyúlik (9. ábra). Mindkét esetben a kapszonok mérete azonos marad. Itt azonosítottuk a nagyobb kapszid evolúciójának egy harmadik mechanizmusát: a kapszomer méretének növelését.

Ez a három mechanizmus nagyon különböző evolúciós korlátokkal rendelkezik. A két klasszikus mechanizmus egyszerű mutációkkal megvalósítható, és már számos alkalommal megfigyelték. Számos vírusban egyszerű pontmutációk módosítják a háromszögszámot5,63,64. Továbbá egyes kapszidok háromszögelési száma az MCP-szekvencia megváltoztatása nélkül is módosítható3,65,66. Hasonlóképpen, a T4-fágban az egyszerű pontmutációk a kapszidot prolatusról izometrikusra alakítják át, vagy olyan óriásfejeket hoznak létre, amelyekben a prolatus fej hosszú tengelye meghosszabbodik4,67. Ezért úgy tűnik, hogy a kapszid térfogatának a két klasszikus mechanizmuson keresztül történő megváltoztatásának evolúciós akadályai meglehetősen alacsonyak. Ezzel szemben az itt azonosított megnagyobbított kapszomer stratégia a kapszidfehérjék szekvenciáinak többszörös, kiterjedt módosítását igényli. A nagyobb P74-26 kapszid az MCP szerkezet nyolc különálló módosításának, valamint a Dec-karnak a nagymértékű megváltoztatását teszi szükségessé (3a, b és 4c, d ábra). Ez felveti a kérdést: miért használta a P74-26 fág ezt a látszólag nagyobb kihívást jelentő evolúciós stratégiát a könnyebb, klasszikus stratégiák helyett? Milyen korlátok akadályozták meg a nagyobb kapszid evolúcióját a klasszikus útvonalakon?

Az első hipotézisünk az, hogy a P74-26 kapszidot stabilizáló lasszók, szárnyak és karok működéséhez nagyobb kapszomerre van szükség. Lehetséges, hogy a lasszóknak extra térre van szükségük ahhoz, hogy eléggé kinyílhassanak ahhoz, hogy a kapocsoszlop szerkezet beilleszkedhessen. Hasonlóképpen, a lebenyeknek és a karoknak is szükségük lehet egy bizonyos hosszúságra ahhoz, hogy stabilizáló hatásukat kifejtsék. Ha ez a helyzet, akkor a kapszidot stabilizáló építészeti elemek a szokásosnál nagyobb kapszomereket igényelnek. Ebben a forgatókönyvben a nagyobb kapszomer a szelektált szerkezeti jellemző, a T = 7 geometria pedig egy spandrel: egy biológiai szerkezet, amely inkább az evolúció mellékterméke, mint a közvetlen szelekció eredménye68. Mi azonban nem támogatjuk ezt a hipotézist, mivel a lassók herpeszvírusokban találhatók, amelyekben a HK97 hajtás tipikus méret (a herpeszvírus MCP-knek számos más toronydoménje van, amelyek növelik a méretet, de ezek a domének nem részei a fő kapszidpadlónak, és nem járulnak hozzá a HK97 hajtáshoz49). Továbbá más Caudovírus MCP-k hosszú N-karokat (pl. Sf6-fág31) vagy a P74-26-hoz közel olyan szélesre nyitott E-hurkokat (pl. P22-fág43) tartalmaznak, de ezek a fehérjék tipikus méretűek. Mindazonáltal ez a hipotézis még nem tesztelt.

A második hipotézis szerint a genom mérete és a kapszidkapacitás kis egyidejű növekedéssel együtt fejlődött. Ha az ősi fág valamivel nagyobb genomot fejlesztett ki, mint amekkora a kapszidban elfér, akkor szelekciós nyomás alakulhatott ki a valamivel nagyobb kapszidra. A T-szám növelése vagy a prolate fejre való áttérés jelentősen megnöveli a kapszid térfogatát, ami a belső nyomás nagymértékű csökkenését eredményezi. Ezek az átmenetek visszatarthatók, mivel a belső nyomást fenn kell tartani a fertőzéshez26. A belső nyomás nagy változásainak elkerülése érdekében a nagyobb kapszidok lassan együttfejlődhetnek a nagyobb genommal.

A végső hipotézisünk az, hogy a kapszidgeometria közvetlen hatással van a teljes kapszidstabilitásra. Feltételezésünk szerint a T = 7 geometria a hexonok változó konformációi miatt eleve stabilabb, mint a magasabb háromszögszámúak. Minden T = 9 vagy annál magasabb T = 9-es kapszidban egynél több hexontípus van jelen, míg minden T ≤ 7-es kapszidban pontosan egy hexontípus van jelen (kivéve a T = 1-t, amelyben nincsenek hexonok69,70). A T = 7 például egyszárnyú hexon-konformációval rendelkezik, míg a T = 9-ben szárnyas és lapos hexonok is vannak (11a., b. kiegészítő ábra). Azt is megjegyezzük, hogy a proláta kapszidok többféle hexontípussal rendelkeznek (általában három vagy több hexonkonformációval; 9. ábra). Így a T > 7 vírusok fő kapszidfehérjéinek alkalmazkodniuk kell a hexonkonformációs heterogenitáshoz, ami hátrányosan befolyásolhatja a stabilitást.

Feltételezzük, hogy a T = 7 geometria a legnagyobb komplexitású (azaz legnagyobb méretű), amely eredendően stabil. A bonyolultabb geometriák a hexon-konformáció variációján keresztül instabilitást vezetnének be. Ennek az eredendő instabilitásnak a mérsékléséhez extra stabilizációs mechanizmusokra lehet szükség, például díszítőfehérjékre, amelyek bebetonozzák a szerkezetet. A T > 7 geometriának két, egymást nem kizáró hátrányát látjuk. Először is, minden egyes különálló hexonkonformációnak működőképesnek és stabilnak kell maradnia, ami a nagyobb stabilitás érdekében korlátozná az MCP-fehérjék evolúcióját. A második előny, hogy az alacsonyabb háromszögszám kevesebb alegység-alegység határfelületet eredményez, így minimalizálva a kapszid gyenge pontjainak számát. E hipotézis alátámasztására az extremofil, archeális HSTV-2 (Halorubrum sodomense tailled virus 2) vírus ~68 kb-os genomját egy T = 7 fej71-be csomagolja. A HSTV-2 a normálisnál nagyobb kapszidot használ, és trimer díszítőfehérjékkel is rendelkezik, amelyek a háromszoros/négyszeres-háromszoros tengelyen ülnek. Az a tény, hogy a kapszid megnagyobbításának ezt a mechanizmusát csak extremofiloknál figyelték meg, alátámasztja azt az elképzelést, hogy a T = 7 geometria kedvező hatással van a stabilitásra. Hipotézisünket tovább erősíti, hogy (tudomásunk szerint) minden ismert T > 7 kapszid díszítőfehérjéket használ, míg sok T = 7 vírusból hiányoznak a díszítőfehérjék.

Ha a különböző háromszögszámok különböző eredendő stabilitással rendelkeznek, ez arra utal, hogy az egyes geometriák a kapszid különböző régióiban gyenge pontokat mutatnak, ahogy azt elméleti munkákból megjósolták72. Feltételezésünk szerint a háromszoros/négyszeres háromszoros tengelyek a T = 7 rács gyenge pontjait képviselik. E hipotézis alátámasztására a T = 7 Caudovírusok díszítőfehérjéi általában a háromszoros/négyszeres-háromszoros tengelyeken találhatók (2. kiegészítő táblázat)29,44,52. Továbbá, ezeket a tengelyeket kovalens keresztkötések stabilizálják a HK97 fágban45 és a T-hurok lebenyek a P74-26-ban (7b. ábra). Ennek az elképzelésnek a további vizsgálatához megjegyezzük, hogy a T = 9 fág szintén használ díszítőfehérjéket a háromszoros tengelyeken73,74, míg a T = 12 és T = 13 fágok díszítőfehérjéket használnak a kapszomerek középpontjain61,75,76.

Megjegyezzük, hogy minden elemzésünk elsősorban a Caudovírusokra összpontosított. Ezek a vírusok életciklusuk részeként általában nem bontják le a kapszidjukat, így a kapszidra nem nehezedik szelekciós nyomás, hogy labilis legyen. Valójában a csomagolt DNS nagy nyomása nagy szelekciós nyomást gyakorol a stabil kapszidok kialakulására. Valószínű, hogy más típusú vírusok más stabilitási mechanizmusokat használnak, különösen azok a vírusok, amelyek életciklusuk szükséges részeként szétszerelik a kapszidjukat.