Abstract

目的。 乳癌におけるKi-67の価値は認識されているが,賛否両論も存在する。 本研究の目的は,estrogen receptor(ER-)陽性,human epidermal growth factor receptor 2-(HER2-)陰性の早期乳癌患者において,progesterone receptor(PgR)発現に応じたKi-67の予後価値を明らかにすることである。 方法 2009年から2012年の間に単一施設で手術を受けた非転移性浸潤性乳癌患者の記録をレビューした。 一次エンドポイントは無再発生存率(RFS),二次エンドポイントは全生存率(OS)とした。 手術後の腫瘍について、Ki-67とPgRを免疫組織化学で評価した。 結果 合計1848人の患者が本研究に登録された。 223名(12%)の患者はKi-67が高発現(≧10%)であり、1625名(88%)はKi-67が低発現であった。 PgRが低い場合(<20%)のみ、Ki-67発現が高い場合と低い場合で有意に悪いRFSとOSが観察された(RFSとOSについては、それぞれ0.005)。 PgRが高値の場合、Ki-67によるRFSとOSの有意差は認められなかった(および0.076)。 Ki-67とPgRの高発現/低発現による4群のRFSが比較された。 低PgR、高Ki-67発現群は、その中で最も悪い転帰を示した()。 多変量解析では、PgRが低い場合、高Ki-67は独立した予後因子であった(HR 3.05; 95% CI 1.50-6.19; )。 結論 Ki-67は,早期乳癌においてPgR発現量が低い場合にのみ,予後因子としての価値を有していた。 Ki-67を用いた乳癌患者の予後評価では,PgRを考慮する必要がある。 はじめに<2218><3895>乳癌患者の予後は非常に多様であり,いくつかの特徴に依存する。 乳癌は病理組織学的,免疫組織化学的(IHC),遺伝学的に異なる異質な腫瘍群である。 予後を推定し、治療計画を決定するために、臨床病理組織学的特性が長い間使用されてきた。 その後、エストロゲン受容体(ER)、プロゲステロン受容体(PgR)、ヒト上皮成長因子受容体2(HER2)、Ki-67の広く利用可能なIHC検査を用いた代替アプローチが開発されてきた … 近年、乳がんの予後予測や全身治療の決定に、ゲノム情報が臨床に取り入れられるようになりました。 しかし、高額な費用と技術的な問題から、世界の多くの地域で遺伝子検査が受けられない場合があります。 バイオマーカーの役割は、患者が特定の治療から恩恵を受けるかどうかを判断するために依然として重要である

増殖の増加は、悪性腫瘍の特徴であり、治療効果を予測するために不可欠なパラメータである。 Ki-67は代表的な増殖指標である。 多くの研究で,Ki-67は無病生存期間や全生存期間と同様に,臨床転帰の予後を予測する独立した治療予測マーカーとして用いられてきた。 しかし、Ki-67の使用については論争もあり、Ki-67は予後判定に欠けるとする研究もある。

The Saint Gallen Consensusでは、「luminal A-like 」と「luminal B-like 」腫瘍の区別を認め、Ki-67が伝える確実な予後情報の価値を支持している …。 多遺伝子解析の発展により、乳癌のサブタイプはより精緻に定義されるようになった。 IHCに基づくluminal A腫瘍の低PgR群は、高PgR群に比べ無病生存率が有意に不良であった 。 以前の研究では、PgR発現≦20%のIHCルミナルA腫瘍の51.3%が内在性ルミナルB腫瘍に分類され、PgR発現<4254>20%のIHCルミナルB腫瘍の30.9%のみが実際に内在性ルミナルB腫瘍であると報告されている . このように、臨床的に使用されているPgRに基づくIHC分類はやや不正確であり、この分類とKi-67発現を組み合わせることで診断精度が向上する可能性がある。

この研究の目的は、Ki-67発現を決定することによる独立した予後予測価値を明らかにすることであった。 そのため、臨床現場におけるKi-67とPgRの発現量の関係を調べ、これらのマーカーの発現と臨床病理学的変数との相関を調べた。 材料と方法

2.1. 研究対象者

2009年7月から2012年12月の間にソウル大学病院外科(SNUH;韓国ソウル市)で手術を受けた病理学的に確認された浸潤性乳癌患者1848人の記録をレトロスペクティブに収集した。 ER陽性およびHER2陰性乳がん患者を、PgRの状態にかかわらず対象とした。 初診時にin-situ carcinomaまたは遠隔転移と診断された患者、あるいは過去に乳癌の手術を受けた患者は、PgRまたはKi-67のデータが入手できない患者と同様に除外された。 ネオアジュバント全身療法を受けた患者も除外しなかった。 IHC解析は、診断におけるコアバイオプシーを用いた組織から行った。 初回組織からの情報が不十分な場合、ネオアジュバント全身療法を受けていない患者には永久切片を用いた。 生検組織は、治療前にネオアジュバント全身療法を受けた患者から採取した。 研究対象は、AJCC(米国がん合同委員会、第8版)の病理学的病期分類によるステージIからIIICと診断された患者であった。 再発は、局所再発と遠隔転移に分けられた。 本試験では、再発のカテゴリーに対側再発は含まれていない。 主要評価項目は、Ki-67とPgRの発現状況に関連した無再発生存率(RFS)であった。 フォローアップ期間は、術後から最終通院日までの期間とし、受診科は問わない。 副次的評価項目は全生存期間(OS)であった。 フォローアップについては、2015年11月までの患者の電子カルテをレビューし、死亡は2013年12月時点の報告に基づいて記録した。 RFSはKi-67およびPgR発現との相関に基づいて4群に分類した

2.2. IHC手順

ER, PgR, HER2, Ki-67発現はホルマリン固定,パラフィン包埋組織ブロックのIHCで測定した。 ホルモン受容体、HER2、Ki-67の発現量は、アビジン-ビオチン複合体法を用いて評価した。 組織は4μm厚の切片に切り出し、キシレンで脱パラフィンし、段階的エタノール系列で再水和し、トリス緩衝生理食塩水に浸漬した。 代表的な切片を免疫染色し、10以上の高倍率視野を無作為に選択し、光学顕微鏡で観察した。 抗原回収後、切片を、ER(1DO5;Dako、デンマーク;1:50)、PgR(PgR636;Dako;1:50)、HER2(CB11;Novocastra Laboratories, upon-Tyne, UK;1:200) および Ki-67(MIB-1;Dako;1 :800)に対する一次抗体と指示希釈でインキュベートした。 次に切片をビオチン化抗マウス二次抗体とインキュベートし、ストレプトアビジン西洋わさびペルオキシダーゼ(Zymed Laboratories, San Francisco, CA, USA)を用いて染色した。 切片はMayerのヘマトキシリンで対比染色し、脱水、清拭し、検査のためにマウントした。 IHCサンプルは、SNUHの経験豊富な病理学者1名によって解析された。 Ki-67 の低発現と高発現を定義するために使用されたカットオフ値は、腫瘍組織の染色核の10%以上 に Ki-67 免疫反応性が存在することであった。 Ki-67 の 10%カットオフ値は、SNUH における予後予測に最も有効であることが判明した。 患者はPgR発現が低い(<20%)腫瘍と高い(≥20%)腫瘍に分けられた。 PgRのカットオフ値20%は、2013年Saint Gallen International Breast Cancer Conference .

2.3 に基づくものである。 統計解析<9766><3895>患者をKi-67低値群・高値群、PgR低値群・高値群に分けた。 臨床病理学的特性は、グループのすべてのペアワイズ比較を用いて評価した。 カテゴリー変数はカイ二乗またはフィッシャーの正確検定を用いて比較した。 連続変数の2群間比較にはStudent’s t-testを使用した。 RFSは、手術日から最初の再発の観察日または再発の証拠がない最後のフォローアップ日までの間隔と定義された。 OSは、手術日から死亡日または最終フォローアップ日までの期間と定義した。 生存率はKaplan-Meier法を用いて推定し、2群間の差はlog-rank検定を用いて比較した。 生存率の単変量解析および多変量解析では、さまざまな因子を調整したCox比例ハザード回帰を使用した。 Cox回帰分析により、ハザード比(HR)および95%信頼区間(CI)が算出された。 値は両側で、統計的有意性は値<0.05と定義した。 統計解析はすべてSPSS software, version 21 for Windows (IBM Corp., Chicago, IL, USA) を用いて行った。 結果

3.1. 患者の臨床病理学的特徴

本研究では,合計1,848名の患者が登録された。 PgR発現量の低いサブセットと高いサブセット,Ki-67発現量の低いサブセットと高いサブセットを比較することで,解析対象患者の臨床病理学的特徴を把握することができた。 平均年齢は、各サブセットとも49-52歳であった。 より大きな癌(>2 cm)は、高Ki-67()および低PgR()とより一般的に関連していた。 組織学的悪性度(HG)は、サンプルを低悪性度と高悪性度に二分し、悪性度3は高悪性度、悪性度1+2は低悪性度と分類された。 また、結節陽性、高HGのサンプルは、高Ki-67、低PgRのサブセットで識別された。 Ki-67の状態にかかわらず、低PgRの症例がより多くネオアジュバント化学療法を受けていることが有意に示された。 さらに、Ki-67が高い症例では、PgRの状態にかかわらず、より多くの症例がアジュバント化学療法を受けた。 また、手術方法による腫瘍の特徴も検討した。 合計719名の患者が乳房切除術を受け、これらの患者は高PgR発現者よりも低PgR発現者の方が多くなっていた。 しかし、Ki-67サブセットと乳房切除術の頻度との間には有意な関連は見られなかった。 PgRサブセットのみが腋窩手術の種類によって有意に異なっていた。 再発は、局所、遠隔を問わず、52名に認められた。 再発は局所再発が10例、遠隔転移が42例であった。 死亡所見は内務省の公開データに基づいており、2013年(死亡データを調べた最後の年)時点で11例が死亡している(表1)。

PgR low (n = 895)67 low (n = 1625)

0.191

2150>

<0.00

0.007

<0.001

0.00001

440(35.9)

0.290

<0.001

13(1.8) 13(1.8) 13(1.8) 13(1.8) 13(1.8)

0.009

特徴 研究対象者数 (n = 1848)
PgR low (n = 895) PgR high (n = 953) value Ki- (n = 4405) Ki- (n = 4406) Ki-67 high (n = 223) value
Age, 平均値(範囲) 52.2 (20-81) 49.2 (22-85) <0.001 50.9 (22-82) 48.6 (20-85) <0.001
Menopausal status <0.001 <1.001
閉経前 413 (46.2) 604 (63.4) 884(54.4) 133(59.6) 閉経後 463(51.1) 閉経後 463(51.7) 324 (34.0) 704 (43.3) 83 (37.2)
不明 19 (2.1) 25 (2.6) 37 (2.3) 7 (3.3) 7 (3.1)
組織型 0.147 0.147 0.183
IDCa 830 (92.7) 860 (90.2) 1479 (91.0) 211 (94.9) 0.6)<4227><4405><4227><2145><8390><2372> ILCa<4227><4405>30 (3.4)<4227><4405>46 (4.8)<4227><4405>71 (4.4)<4227><4405>5 (2.0)<4405>5 (2.2)<4227><4405><4227><2145><8390><2372> その他<4227><4405>35 (3.9)<4227><4405>47 (4.9)<4227><4405>75 (4.6)<4227><4405>7 (3.6) <4405>35 (4.9)<4227><4405>47 (4.9) <4227><4227><4405>75 (4.6)<4227><4405>7 (3.6) <4405>35 (4.9) <44051)
腫瘍サイズ(cm) <0.001 <0.001 0.00001
≤2 452 (50.5) 564 (59.2) 919 (56.6) 97 (43.5)
>2 443 (49.5) 389 (40.8) 706 (43.4) 126(56.5)
LN 転移 <0.001
Negative 541 (60.4) 693 (72.7) 1103(67.9) 131(58.7)
Positive 354(39.0) 340(35.06) 260 (27.3) 522 (32.1) 92 (41.3)
組織学的グレード <0.001 <0.001 0.001
Low (I, II) 565 (66.6) 727 (76.3) 1243 (76.5) 80 (35.0) 80 (35.9)<4227><4405><4227><2145><8390><2372> High(III)<4227><4405>299(33.4)<4227><4405>226(23.7)<4227><4405>382(23.5)<4227><4405>143(64.3)<4407><4227><4405>382(64.1)
乳房手術 0.001 0.001 0.443
乳房部分切除術 511 (57.1) 618 (64.8) 998 (61.9).4) 131(58.7)
乳房全摘術 384(42.9) 335(35.2) 627(38.3) 340(35.2) 440(35.8) 335(35.9) 440(35.86) 92 (41.3)
Axilla操作 <0.001
センチネルリンパ節生検 491 (54.9) 643 (67.5)<4227><4405>1005 (61.8)<4227><4405>129 (57.8)<4227><4405><4227>2145><8390><2372> 軸索節郭清<4227> <4405>404 (45.0) <4227><4405>404 (45.1) 303 (31.8) 613 (37.7) 94 (42.2)<4227><4405><4227><2145><8390><2372> 行っていない<4227><4405>0(0.0)<4227><4405>7 (0.7)<4227><4405>7 (0.4)<4227><4405>0 (0.4) <4227><4405>0 (0.0)
再帰 0.043
No 861(96.2) 935 (98.1) 1589 (97.8) 207 (92.8)
Locoregional 6 (0.7) 4 (0.4) 7 (0.4) 3 (1.3)
Distant 28 (3.1) 14 (1.0) 1 (1.5) 29(1.8) 13(5.8)
Death 0.5(0.8) 14(1.8022
No 885 (98.9) 951 (99.8) 1618 (99.8).6) 218 (97.8)
Yes 9 (1.0) 2 (0.2) 6 (0.4) 5 (2.1) 6 (0.2) 9 (0.2) 6 (0.2) 5 (2.2) 5 (0.2) 5 (0.2) 1 (0.1) 0 (0.0) 1 (0.1) 0 (0.0)<Unknown> (0.1)<4227> 1 (0.2)<<4228><0.2><3.1><4.0)
PgR: progesterone receptor, IDCa: invasive ductal carcinoma, ILCa: invasive lobular carcinoma, LN: lymph nodeを示す。 Ki-67とPgRの発現による患者の転帰

表. 1
Clinical and histopathologic characteristics.

RFSはKi-67低発現群の患者がKi-67高発現群より有意に良好であった(;図1(a))。 また、RFSもPgR高発現群がPgR低発現群に比べ有意に良好であった(;図1(b))。


(a)

(b)

(a)
(b)
図1
Recurrence->RefS (RfS)。Ki-67指数とプロゲステロン受容体の発現状況による無再生期間(RFS)の違い。 (a) 全患者(n = 1848);Ki-67に応じたRFS。 (興味深いことに、サブセット解析では、Ki-67の発現状況に基づくRFSは、低PgRサブセットでは有意差があったが、高PgRサブセットでは有意差がなかった。 具体的には,Ki-67発現が高く,PgR発現が低い患者(<7654>20%)のRFSは,Ki-67発現が低く,PgR発現が低いグループより悪かった(;図2(a))。 一方、PgR高発現(≧20%)群では、Ki-67高発現群と低発現群の間に有意差はなかった(;図2(b))。


(a)

(b)

(a)
(b)
図2
Recurrence-

RFSはさらに、Ki-67とPgR発現に基づいて4群に分けられたサブセットと相関させて分析された。 PgRが低くKi-67が高い症例は他の3群に比べ最も予後が悪かった(;図3)。

図3
Ki-67とプロゲステロン受容体の発現量の組み合わせで4群に分けて無再発生存率を検討した。

多変量Cox回帰モデルでは,Ki-67発現群,年齢,腫瘍径,結節状態,HGなどの因子を調整した結果,Ki-67はPgR高発現状態と有意に関連しなかった(HR 2.03; 95% CI 0.61-6.72; ; Table 2). 低PgRサブセットの患者では、Ki-67はRFSと顕著に関連していた(HR 3.05; 95% CI 1.50-6.19; ; 表2)。 腫瘍の大きさは、いずれのPgRの状態でもRFSと統計的に有意であった。

表2
Multivariate Cox Regression Analysis for Recurrence-free Survival.

副次評価項目であるOSの解析でも同様に、PgR発現の低いKi-67サブセットで優れた生存率を示し(;図4(a))、高PgR群ではKi-67サブセット間のOSに有意差はなかった(;図4(b))。


(a)

(b)

(a)
(b)
図4
高および低Ki-67群患者における全身生存(OS).67 乳癌、プロゲステロン受容体発現状態別。 (a) 低プロゲステロン受容体発現サブセット(PgR < 20%)におけるKi-67に応じたOS。 (b) 高プロゲステロン受容体発現サブセット(PgR≥20%)におけるKi-67に応じたRFS。

平均無病生存期間は、低PgR/高Ki-67サブセットで70ヶ月、高PgR/低Ki-67サブセットで75ヶ月であった。 全生存期間の平均は,低PgR/高Ki-67サブセットで74カ月,高PgR/低Ki-67サブセットで76カ月であった。 議論

ここで,ER陽性およびHER2陰性の非転移性乳癌患者の再発および生存に関する独立予後因子としてKi-67の価値を評価した. これまでの報告と同様に、Ki-67の発現は有意な予後因子としての価値を示したが、さらにKi-67が必ずしも独立した予後因子ではないことを明らかにした。 特に、Ki-67はPgR低発現群でのみ予後因子としての価値を有していた。 本研究では、4つの発現サブグループ間のRFSを比較すると、低PgR高Ki-67サブグループで最も予後が悪いことが明らかになった。 そして、そのサブグループは1848例中120例であった。 したがって、約6%の患者さんで積極的な治療が検討される可能性がある。 予後予測に関しては、Ki-67発現量とPgR発現量を組み合わせることで、予測値が向上することが示唆された。 Allison らは、Oncotype DX 再発スコアが高く、PR 発現がグレード 3 で低発現から消失、Ki-67 > 10% と強い相関があることを報告している。 さらに、Thakur らは、Ki-67 の状態が高いほど、Oncotype DX の再発リスクが高いグループ(低 対高、)と有意な相関があることを示した 。 ゲノム解析ができない場合,ER陽性・HER2陰性乳癌でPgR低発現・Ki-67高発現の患者を積極的治療で検討することも可能である。 しかし,これらの知見を臨床応用する前に,独立した検証や場合によっては前向き研究など,さらなる研究が必要である

我々の論文は,いくつかの追加の問題を提起している。 Ki-67は乳癌の予後マーカーとして20年以上研究されているが,その発現を決定するために使用される方法と発表された結果の全体的な分析的妥当性をめぐって論争がある。 分析的妥当性とは、再現性のある正確な結果をもたらす検査の能力のことである。 あるマーカーが予後予測的な価値を持つためには、証拠に基づく「最適な」カットオフポイントが不可欠である。 したがって、マーカーとしてのKi-67の使用をめぐる論争の理由の一つは、普遍的に受け入れられた標準カットオフ値が存在しないことであり、その結果、検査室ごとに異なる特定の閾値が使用されることになった。 我々の施設では、10%のカットオフ値で最良の予後予測結果が得られることを以前に実証している。 この値は、2011年にSaint Gallen Consensusで示されたカットオフ値とは異なる。Saint Gallen Consensusでは、Ki-67 index <14%のものを「低増殖」腫瘍と定義し、PAM50固有多遺伝子分子検査と比較して管状癌の分類を確立したカットオフ値であった … 2013年のサンクトガーレン会議では、Ki-67が高いことを示す閾値を20%以上に引き上げることが、大多数のパネリストの投票により決定された。 サンクトガーレン合意による単一のカットポイントの最終的な定義は、Ki-67の連続的な分布、標準化された評価に対する分析および分析前の障壁のために、依然として不明確であった。 私たちの研究所で使用されているカットオフは、私たちの研究にとって適切なものですが、観察者間のばらつきをさらに減らすために、Ki-67評価の標準化に関する議論は今後も続くでしょう。 10%ではなく、14%や20%を使用した場合に、Ki-67の予後判定値として報告された結果が再現されるかどうか、分析が必要である。 Ki-67のカットオフ値を14%とした場合、Ki-67による差はなかった。 Ki-67によるRFSは統計学的に有意ではなく(;付録1)、PgR発現サブセットによるKi-67の低値と高値の違いも示さなかった(;付録2a、;付録2b)。 Ki-67を腫瘍増殖の生物学を反映する連続的なマーカーとして使用することが最良の戦略である。 さらに、個々の患者に対する治療の決定は、与えられたカットオフ点付近のKi-67のわずかな差に依存すべきではない」

我々の知る限り、これはKi-67の日常的使用と予後の意義について、高品質の臨床がん登録からデータを分析した最大のレトロスペクティブ研究の1つである。 レトロスペクティブではあるが、選択バイアスのない非転移性乳がん集団で構成されているという利点がある。

マーカーとしてのKi-67の様々な限界にもかかわらず、乳がん分野での臨床使用はいくつかの理由で採用されてきた。 内腔腫瘍の鑑別に使用され、予後因子と考えられている。 IHCによるKi-67の評価は安価であり、高度な機器に投資することなく容易に実施できるため、低コストバイオマーカーとしてのKi-67という魅力的な概念につながっている。 また、症例に応じた化学療法の選択が不確定であることから、臨床的な柔軟性が重要であり、より正確なKi-67の役割を確立することの重要性が強調された。 さらに,PgRが低くKi-67の発現が高い患者は,RFSの点で予後が最も悪いことが分かった。 世界的な観点からは、ほとんどの患者にとって、ゲノムシグネチャーへのアクセスは当面困難なままであろう。 早期ER陽性,HER2陰性乳癌で,低PgR,高Ki-67の条件を満たす症例では,積極的治療がデフォルトと考えることができる

5. 結論<2218><3895>今回の結果から,ER陽性・HER2陰性早期乳癌患者において,Ki-67はPgR発現量が低い場合にのみ再発・生存の予後を左右することが明らかとなった。 したがって、Ki-67を用いて乳がん患者の予後を評価する際には、PgR発現も考慮すべきである。

Data Availability

この研究の結果を裏付ける統計解析の目的で収集した人口動態および臨床データは、要望に応じて対応する著者から入手可能である。

利益相反

著者は、本論文の発表に関して利益相反がないことを宣言する。

補足資料

付録1:14%カットオフ値によるKi-67指数による無再発生存期間(RFS)。 付録2a:低プロゲステロン受容体サブセットにおけるKi-67(14%カットオフ値)に応じた無再発生存率(RFS)。 添付資料2b: 高プロゲステロン受容体サブセットにおけるKi-67(14%カットオフ値)に応じた無再発生存期間(RFS)。 (補足資料)

あり、なし

2.0cm

2.03 (0.61-6.77)

高い、低い

0.82(0.28-2.40)

低PgR状態 高PgR状態
HR (95% CI)
Age 1.00 (0.97-1.03) 0.856 0.99 (0.95-1.04) 0.713
腫瘍サイズ ≧2 cm、<2 cm 7.20 (2.53-20.51) <0.5(0.05) 0.001 5.40 (1.49-19.60) 0.010
結節状態 1.0cm 3.0cm 5.0cm。66 (0.79-3.45) 0.179 2.53 (0.94-6.77) 0.065
Ki-67 ≥10%, <10% 3.05 (1.50-6.19) 0.002 2.72) 0.247
HG 1.78(0.85-3.72) 0.127 0.719

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