3.1.2 Azides
Azide は生体内直交反応やクリックケミストリーに最も適した基の1つであると考えられています。 ケトンやアルデヒドとは対照的に、アジドは生体内にほとんど存在しない。 アジドは高い固有エネルギーを持つが、天然の反応パートナーがいない（King and Wagner, 2014）、サイズが小さく全体の電荷が中性である、そして最後に生理的条件下で動力学的に安定である。
Staudinger ligation（Staudinger and Hauser, 1921）はアジドを用いたバイオコンジュゲーション反応の良い候補と思われます。 この反応では、アジドは親電子トラップを含むトリフェニルホスフィン試薬と反応してアザイリド中間体を生成し、親電子エステルカルボニル基と反応して5員環を形成し、加水分解を受けて最終的に安定なアミド結合を生成する（図5・6A）（Steen Redeker et al.2013; Staudinger and Hauser, 1921）。 この反応の新しい変形は、その直後に記載され（King and Wagner, 2014; Saxon and Bertozzi, 2000; Saxon et al., 2000; Nilsson et al., 2000）、「traceless Staudinger ligation」と呼ばれ、最終アミド結合生成物がホスフィンオキシド部位から遊離される。”
FIGURE 5.6. アジドを用いたバイオコンジュゲーション反応の例。 (A）シュタウディンガーライゲーション、（B）銅触媒によるアジドアルキン環化付加反応、（C）株間促進アジドアルキン環化付加反応、（D）オキサノールボルナジエンを用いた環化付加反応。 UAA, unnatural amino acids.
Staudinger ligationは様々なアプリケーションで採用されている。 例えば、Rainesらはこの反応をNCLに代わるシステインを含まないペプチドライゲーションとして応用し(Nilsson et al., 2001)、NCLと組み合わせて人工RNAase Aのアセンブリに用いた(Nilsson et al., 2005)。 さらに、他の用途、例えば、in vitro および in vivo イメージングのための固体支持体へのタンパク質固定化 (Saxon and Bertozzi, 2000; Prescher et al., 2004), in vitro および in vivo における生体分子の標識 (Saxon and Bertozzi, 2000; Prescher et al., 2004) に使用された。 2004; Vocadlo et al., 2003）、タンパク質の濃縮（Vocadlo et al., 2003）および検出（Charon et al., 2009）、さらに（Lemieux et al., 2003）タンパク質修飾がある。 すなわち、その遅い速度論（10-3 M-1s-1の範囲の低い2次の速度定数）（Lin et al, 2005）、ホスフィン化合物の酸化しやすさ（比較的高濃度のホスフィン試薬を使用する必要がある）、ホスフィンがジスルフィドと交差反応する可能性（Lang and Chin, 2014; King and Wagner, 2014）である。
アジドは、クリックケミストリー反応の最も標準的な例の1つであるCu（I）触媒によるアジド-アルキン環化付加反応（CuAAC）または1，3-双極性環化付加反応（図5・6B）においてアルキンと反応し得る（Rostovtsev et al, 2002; Tornøe et al., 2002)。 この反応は、選択性が高く、収率が高いこと、反応条件が温和であること（様々な溶媒で室温）から、生物科学分野において高い関心を集めている。 また、アジド、アルキンともにタンパク質の構造や機能に影響を与えることなく導入することができる（Steen Redeker et al.、2013）。 アジドとアルキンは、生理的条件下で、Cu(I)の存在下、非常に速く安定な1,2,3-トリアゾール結合を形成することができる。 Sharplessら（Rostovtsev et al., 2002）が提案した機構では、まず末端アルキンが銅アセチリドに導入され、その後にアジドが攻撃されると説明されている（King and Wagner, 2014）。 近年、この機構はさらに改良され、二銅の中間体が提案されている（Worrell et al.、2013）。 この反応の大きな欠点は、Cu(I)依存性の副反応とCu(I)の細胞毒性であり（Baskin et al., 2007; Plass et al., 2011）、主に細胞外空間での標識への応用に制限があった（King and Wagner, 2014）。 CuAACは、多くの異なる生物学的研究において広く用いられており、例えば、リン脂質を標識してin vivo（Jaoら、2009）およびin vitro（NeefおよびSchultz、2009）でイメージングするため、ウイルス表面のリモデリング（Steinmetzら、2009）にも使用されてきた。 2009）、in vitroおよびin vivoでのタンパク質の修飾/標識（Link and Tirrell, 2003; Ngo and Tirrell, 2011; Liu and Schultz, 2010; Deiters et al., 2003）、核酸の標識（Weisbrod and Marx, 2008）、およびアフィニティーベースのプローバープロファイリング（Speers et al. すなわち、銅（I）の配位に水溶性リガンドを用いる方法、銅をキレートする有機アジドを用いる方法、アルキン部位に環歪みを導入する方法などである。 最初のケースでは、水溶性配位子がCu(I)を配位して活性化銅触媒を形成し、低ミクロモル濃度の金属でCuAACを促進すると同時に、Cu(I)の潜在的毒性を低減できる（Besanceney-Webler et al, 2011; Del Amo and Wang, 2010; Hong et al, 2009; Kennedy et al, 2011）。 第2のケースでは、銅キレート部位を内部に含むアジド配位子を用いて、反応部位での有効銅（I）濃度を上げる（Brothertonら, 2009; Kuangら, 2010; Uttamapinantら, 2012）。 最後の戦略は、触媒の不在下で改善された動力学で反応するように活性化されたアルキンを使用することである。 この点で、シクロオクチンの部位を使用すると、環状歪みの解放の結果として反応性が向上します（Steen Redekerら、2013年；Baskinら、2007年；Plassら、2011年）。 歪み促進アジドアルキン環化付加反応（SPAAC）（図5.6C）は、追加の試薬や生体分子を損傷する可能性のある毒性金属が必要ないため、タンパク質や抗体の標識のみならず、抗体なしのウェスタンブロット解析（Boutureira et al.、2015）など他の用途でも強力なツールとなっています。 例えば、Bertozziらは精製タンパク質の修飾にその適用性を証明しました（Baskin et al.） さらに実験では、この反応をin vitroで線維芽細胞に適用することに成功した(Baskin et al.、2007)。 さらに、SPAACは、ナノ粒子を用いて生きたマウスの腫瘍を画像化したり（Kooら、2012）、フッ素がアジドとシクロアルキンの両方に結合している18F PETにも用いられた（Jeonら、2012）。 その他、ウイルスの修飾やDNAの標識にも応用分野が見出された（Qiu et al.） しかし、シクロオクチンの合成は複雑であり、嵩高性や疎水性の増大がタンパク質の構造や安定性に影響を与えるという事実がある（Kim et al, 4801>
電子不足のスルホニルアジドは、SPAAC（Alder、1930；Huisgenら、1980）と同様に、金属を含まない環化付加反応（図5.6D）で活性化アルケン（オキサノールボルナジエンまたはノルボルネン）とも反応しうる。） しかし、アジド-アルケン環化付加反応の生成物は、古典的なクリック環化反応で生成する芳香族トリアゾールと異なり、比較的不安定なトリアゾリンである。 歪みと電子不足を併せ持つオキサノルボルナジエンは、アジドとの反応において双極子として用いられた（van Berkel et al.、2008）。 この場合、oxanorbornadiene の歪んだ二重結合はアジドと反応して中間体トリアゾリンを形成し、これが自発的にレトロディールスアルダー反応を起こし、フランが遊離して安定な 1,2,3- または 1,4,5-triazole に至る。 この反応を利用して、水系緩衝液中でオキサノルボルナジエン官能基化タンパク質とアジド修飾環状ペプチドを選択的にバイオコンジュゲートすることができた。 オキサノールボルナジエンはシクロオクチンに比べて合成が容易であるが、この環化付加反応はかなり遅く、タンパク質に見られる他の官能基に対して完全に化学選択的でないため、その普及には限界があったと考えられる（Lang and Chin, 2014; van Berkel et al, 2008）
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