Introduction
2050 年までに 90 億人に達すると予想される世界人口（http://www.unpopulation.org）に対して十分な食糧および栄養を提供するには、少なくとも 60％米収量を増加する必要があります (FAO 2009)。 米は世界人口の半分以上の主食であり、この米消費人口は年率1.098%で増加している(http://esa.un.org/wpp/Excel-Data/population.htm)。 人口の増加は、食料、水、土地に対する需要の増加を意味し、その一方で、大規模な農地が食料生産から工業化やバイオ燃料生産に転用され、農業のための天然資源基盤が劣化しつつある。 予測不可能な気候変動は、干ばつや洪水の頻度を増やし、農業に適した土地をさらに減少させる恐れがある（http://www.fao.org/docrep/017/aq191e/aq191e.pdf）。 人口増加と世界的な気候変動により世界の食糧供給への圧力が高まる中、人口増加に対応するために穀物生産性の面で作物のパフォーマンスを向上させ続けることが不可欠である。 緑色革命の時代に生まれた植物種による作物生産性の向上は、二度の世界大戦後の人口急増を支えた。 それ以来、改良品種や先端技術の利用にもかかわらず、現在のイネ品種の収量ポテンシャルはわずかに向上したに過ぎず、これらの品種は収量の上限に達している（秋田 1994）。 最近、イネに効率的なC4型光合成を導入することで、イネの収量性を向上させる試みが行われている（Kajala et al.） そのためには、葉の構造および生化学的プロセスを制御する一連の遺伝子をイネに挿入し、適切な方法で発現させる必要があるが、これは現在のところ、従来の植物育種技術だけでは不可能である。 したがって、イネの光合成経路を改良するための遺伝子工学は、潜在的な収量だけでなく、実際の穀物生産性を高めるのに十分な機会を提供すると考えられる。
イネのようなC3植物では、光合成酵素であるリブロース-1、5-ビスリン酸カルボキシラーゼオキシラーゼ（ルビスコ）により、二酸化炭素が炭素3つの化合物に同化される。 ルビスコはその名の通り、リブロース-1, 5-ビスリン酸（RuBP）の酸化も触媒し、光呼吸として知られる無駄なプロセスで、以前に固定した炭素の最大25％が失われることもある（Sage 2004）。 世界の熱帯稲作地域の典型である 30℃以上の温度では、酸素化率が大幅に上昇し、C3 植物の光合成効率が最大で 40％低下する（Ehleringer and Monson 1993）。 このため、熱帯・温帯地域のイネの光合成は非効率になる。 葉にCO2濃縮機構を持つC4植物は、光呼吸のレベルが非常に低く、高温で乾燥した環境でも生育できるように進化しており、作物の改良戦略にとって貴重な洞察を与えてくれる。 C4光合成機構を持つイネは、土地、水、肥料（特に窒素）などの希少資源をより有効に利用しながら、光合成効率を高めることができるだろう（Hibberd et al.2008）。 C4 光合成は、植物が大気中の二酸化炭素を固定するために採用する 3 種類の生化学的メカニズムの 1 つで、他には C3 および Crassulacean acid metabolism (CAM) 経路があります。 C4型光合成は、被子植物がC3型から進化する過程で、少なくとも19科で66回以上独立して進化し(Sage et al. 2012) (Muhaidat et al. 2007) 、細胞構造、生化学、ひいては葉の発達に変化をもたらしている。 この高度に特殊化した光合成の形態は、本質的にルビスコ酵素の周りにCO2濃縮機構を発達させ、ルビスコの酸素添加機能を排除し、それによって光呼吸によるエネルギーの浪費を減少させている（Douce and Heldt 2000）。 C4種のRubiscoは、C3種よりもカルボキシル化の効率が高い（Kubien et al.2008）。 C4 システムのその他の関連する利点としては、部分的に閉じた気孔によって CO2 拡散のための急な濃度勾配を維持できるため水利用効率が高く、C4 光合成効率は高い光強度で飽和しないため放射線利用効率が高く (Rizal et al. 2012) 、必要なルビスコ量が少なく、したがって窒素利用効率が高くなることである (
C4 植物は、イネの通常経験する高温での生産性も高くなると考えられる。 人口と食料価格が高騰している現在、このより効率的な光合成システムを利用するために、トウモロコシに見られるようなC4機構をイネに挿入する取り組みが行われています（Rizal et al.） イネの光合成システムを改変するこの新しいアプローチは、C4経路が非常に複雑で、そのメカニズムを制御する多くの要因が未知であるため、困難で長期にわたる試みである。 そのため、遺伝子工学、生化学、バイオインフォマティクス、分子生物学、光合成、システム生物学、生理学、植物育種、メタボロミクスなど、様々な分野の研究者の創意工夫と専門知識が必要とされる。 そのため、C4イネコンソーシアムが構想・設立され、2009年からC4イネ工学の実用化が開始された（http://photosynthome.irri.org/C4rice/）。 本総説では、C4イネの開発に必要な条件と、遺伝子工学分野の進展について紹介する。 C3種からC4への進化とそれに伴う変化の研究に基づき、イネで機能的なC4光合成経路を確立するためには、以下のような改良が不可欠であると考えられる。
イネの束鞘細胞における葉緑体の数とサイズを増加させる
イネでは、葉緑体全体の90％以上が葉内の中葉細胞（MC）に位置している（吉村ら 2004）が、C4植物ではMCと束鞘細胞（BSC）の両方が同数の葉緑体を有する（図1AおよびB）。 これは、C3植物では光合成の全過程がMCで行われるのに対し、C4植物では光合成の過程がMCとBSCに区分けされているためである。 MCでは最初のCO2固定が行われ、オキサロ酢酸という炭素数4の化合物が生成され、これがリンゴ酸などのC4酸に変換されてBSCに運ばれ、BSCのカルビンサイクルによりCO2から糖質が効率よく同化される。 このように、C4植物のBSCは、C3植物と異なり、C4化合物の脱炭酸やカルビンサイクルの過程など、光合成機能を有しているのである。 これらのプロセスを行うために、C4植物のBSCは肥大化し、葉緑体の数が増えることで、BSCがより顕著になり、光合成活性が高まるのです。 C3種のBSCは、水圧のバランスをとる、細胞間隙から木部への空気の侵入を防ぐ、蒸散による損失を緩衝するための水の貯蔵庫となる、葉脈に当たるより強い光を葉の中に取り込み拡散させるなどの機能を持つ（Nikolopoulos et al.2002)。 C3植物のBSCのその他の機能には、窒素、硫黄、炭水化物の輸送やシグナル伝達経路での役割が含まれ、Leegood 2008で広く概説されている。 C4植物では、BSCとMCは光合成の2段階バージョンで協力し合う。 そのため、C4植物はBSCとMCが直接接触するように、BSCの葉緑体の増殖を伴う特殊な葉の構造を持っている。 イネにC4経路を導入するためには、BSCに現在よりも多くの光合成葉緑体が必要である。 そのためには、葉緑体の発生に必要な遺伝子要素、例えばGolden2-like (GLK) 遺伝子を、C4遺伝子プロモーター、例えばMC特異的発現にはZea maysのPEPC、BSC特異的発現にはZoysia japonicaのPCKを用いて細胞特異的に過発現させればよい（松岡ら, 1985）。 1994; Nomura et al. 2005）。
C3葉とC4葉の解剖学的相違点。 (A) C3 (Oryza sativa L., イネ品種IR64) と (B) C4 (Setaria viridis) の葉。 イネのメソフィル細胞（MC）には葉緑体が多く、全体の90%以上を占めているのに対し、束鞘細胞（BSC）には葉緑体の数が少なく、全体の10%以下であることが分かります。 C4葉では、葉緑体はBSCにもMCにも局在しています。
Golden2-like (GLK) 遺伝子ファミリーは核転写因子をコードしており、アラビドプス、ゼアマイス、ヒメコオロギで葉緑体の発達に関与しています (Rossini et al. 2001). これらの種では、GLK遺伝子はGLK1およびGLK2と名付けられた相同なペアとして存在している（Waters et al.2009）。 コケとシロイヌナズナではGLK遺伝子は冗長で機能的に同等であるが、トウモロコシとソルガムではGLK遺伝子は細胞型特異的に作用して二型の葉緑体の発生を誘導する（Waters et al.2008、Wang et al.2013a）。 トウモロコシでは、Golden2（G2）とそのホモログであるZmGLK1の転写物が主にBS細胞とM細胞に蓄積することから、それぞれの遺伝子が二形性葉緑体の分化を制御する特定の役割を担っていると考えられる（Wang et al.2013a）
葉脈間隔を狭め、葉脈の密度を高める
C3種において光合成はMCで行われます。 連続する葉脈の間にMCの数が多いと（図1A）、葉脈が互いに遠ざかり、葉脈の間隔が広がるか、葉脈密度が低下する。 イネの葉では1mmあたり6本以下（図2A）、Setaria viridisとソルガム（ともに典型的なC4種）では1mmあたり7本以上（図2BとC）である。 C4の葉は平均して、葉脈の間に2つのMCがある（図1B）。 C4植物の葉では、葉脈の密度が高いため、M組織とBS組織の体積がほぼ1対1になっていることがわかる。 C4葉の内部構造は、多くの場合、静脈-BS-M-BS-静脈の繰り返しパターンで構成されている。 このような葉の構造は、ドイツの植物学者G. Haberlandtによって “Kranz anatomy “と呼ばれ、MCに囲まれたBSCは花輪のような構造をしている。 C4 BSCは細胞質が緻密で、多数の葉緑体で満たされている（図1B）。 C4経路が効率よく機能するためには、M細胞とBS細胞の密接な接触が不可欠であり、これらは多数のプラスモデズマタDenglerと（Nelson 1999）で互いに緊密に連結している。 クランツ解剖学は、C4光合成経路の2細胞モードを利用するほぼすべての単子葉植物と双子葉植物の系統で、ほとんど変異なく見いだされる。 葉の解剖学と形態に関する研究により、葉の細胞の成長、発達あるいは変形に関わるいくつかの遺伝子が明らかにされた。 ACAULIS1という遺伝子は、葉の細胞の伸長に関与していた（Tsukaya et al.1993）。 CURLEY LEAF (CLF) 遺伝子の変異は、シロイヌナズナの葉をカールさせた (Kim et al. 1998)。 rotunda 1 (RON1) 遺伝子の変異により、自由脈末端の増加、開脈パターン、丸みを帯びた葉の構造が生じた (Robles et al. 2010)。 トウモロコシの Scarecrow 遺伝子の変異は、BSC の数の増加、BS 葉緑体の異常な分化、小脈の減少、葉脈密度の変化を示した (Slewinski et al. 2012)。 このように、特定の遺伝子の変異によって引き起こされる葉脈のパターン異常に関する研究は、クランツ解剖学がどのように制御されているかを知る手がかりとなり、クランツパターンの形成には複数の経路が関与していることが示唆された。 SCARECROW/SHORTROOT制御ネットワークは、Scarecrow遺伝子を変異させたC3植物の葉は正常であったが、同じ遺伝子を変異させたC4植物ではクランツ模様が損なわれたことから、クランツ模様の形成に必要な重要な要素の1つであると決定した（Slewinski et al.2012; Wang et al.2013b)． 最近、オート麦にトウモロコシの染色体を導入すると、C3オート麦の葉のBSCサイズが大きくなり、葉脈の間隔が狭くなることが示され、C3葉の解剖学的構造が改変できることが示された（Tolley et al.2012）。 さらに、葉脈間隔を増加させたソルガム（C4）変異体や葉脈間隔を減少させたイネ（C3）変異体をスクリーニングし、葉脈間隔形質を制御する遺伝子を特定することにも大きな努力が払われている（Rizal et al.2012）
C3とC4植物間の葉脈密度における変動． (A) C3 (Oryza sativa L., イネ品種 IR64), (B) C4 (Setaria viridis), (C) Sorghum bicolor の葉の切片の葉脈密度を示す。 イネはS. viridisやソルガムなどのC4植物と比較して葉脈密度が低い。
カルビンサイクルの活性は、イネのMCでは著しく低下し、BSCでは著しく向上するはずだ
C4光合成は、ルビスコ部位でのCO2濃度を上昇させる生物化学的CO2ポンプ機構によって特徴づけられる。 ルビスコ周辺の高濃度のCO2は、光呼吸の速度を低下させ、高効率の光合成につながる正味のCO2同化を増加させるWeberとvon (Caemmerer 2010). このため、C4ではCO2同化をMCとBSCの2つの細胞タイプに分散して行っている（図3）。 したがって、C4の炭素固定は、細胞特異的な遺伝子の発現と局在に依存している。 隣接する光合成活性の高いBS細胞とM細胞は相互作用し、ルビスコ触媒によるO2固定を解消する。 2細胞型C4植物では、CO2はまずMCでホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（PEPC、EC 4.1.1.31）というO2非感受性カルボキシラーゼによってオキサロ酢酸というC4酸に固定化される。 その後、オキサロ酢酸はリンゴ酸またはアスパラギン酸に変換され、BSCに運ばれて脱炭酸され、CO2が放出される。 このCO2はルビスコによって再固定され、その後のカルビンサイクルのすべての活動はBSCの葉緑体で行われる（Nelson and Langdale 1989）。 したがって、C4イネを機能させるためには、ルビスコ活性をMCで大幅に低下させ、BSCで増加させる必要があり、これによりカルビンサイクルがC4システムと同様にイネのBSCに限定されることになる。 一方、イネのMCの細胞質では、β-炭酸脱水酵素（CA）やPEPCなどのC4酵素をコードする遺伝子が過剰発現しており、CO2を濃縮してBSCのルビスコに供給できるよう、一次CO2固定を促進する必要があった。 また、C4サイクルは、MCとBSCの葉緑体包膜と形質膜を介した代謝物の大規模な輸送を伴います（図3）。 そのため、C4の中核酵素であるCA、PEPC、ピルビン酸オルトリン酸（Pi）ジキナーゼ（PPDK、EC 2.7.9.1）、NADP依存性リンゴ酸脱水素酵素（NADP-MDH、EC 1.1.1.82） およびNADP依存性リンゴ酵素（NADP-ME、EC 1.1.1.1.40）、C4経路はオキサロ酢酸、リンゴ酸、トリオースリン酸、ピルビン酸の代謝物トランスポーターをイネに挿入し、C4サイクル中間体の輸送能力を高め、BSCでカルビンサイクルが有効に機能できるようにする必要があります（Weber and von Caemmerer 2010）。
C4稲コンソーシアムがインディカ米品種に遺伝子操作しているC4光合成のNADP-MEサブタイプの簡単な生化学パスウェイ。 PEPCはMCで最初のカルボキシル化を行い、オキサロ酢酸を生成し、さらにMDHによってリンゴ酸に変換される。 このC4酸はMCからBSC葉緑体に運ばれ、NADP-MEによってピルビン酸に脱炭酸され、CO2はルビスコに放出されてカルビンサイクル反応が行われる。 C4イネでは、ルビスコはBSCに発現しているため、その部位でCO2濃度が上昇すると酸素化活性が低下し、結果として光呼吸が抑制される。 3-PGA: 3-Phosphoglycarate（3-ホスホグリコール酸）、CA: 炭酸脱水酵素、DiT1: ジカルボン酸トランスロケーター1、DiT2：ジカルボン酸トランスロケーター2、MEP：メソフィル エンベロープタンパク質、NADP-MDH：NADP-リンゴ酸脱水素酵素、NADP-ME：NADP-リンゴ酸酵素、PEP：ホスフェノールピルビン酸、OAA：OAA: オキサロ酢酸、OMT：オキソグルタレート/リンゴ酸トランスロケーター、PEPC: ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、PPDK：ピルビン酸オルトリン酸（Pi）ジキナーゼ、PPT: ホスホエノールピルビン酸トランスロケーター、Rubisco: Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, RuBP: Ribulose-1,5-bisphosphate, および TPT:
葉緑体細胞における光呼吸は大幅に減少しなければならない
C3植物では炭素固定とカルビンサイクルがMCで行われる。 炭素固定では、リブロース1,5-ビスホスフェート（RuBP）-炭素数5の化合物が、酵素リブロース1,5-ビスホスフェートカルボキシラーゼオキシゲナーゼ（ルビスコ、EC.4.1.39）によって、CO2と反応して、3-リン酸グリセライド（3-PGA）という炭素数の多い2分子の化合物を生成しています。 カルビンサイクルの中で、2つのPGA分子はエネルギーに富む糖（トリオースリン酸）分子を形成し、次のサイクルのためにRuBPを再生させる。 現在の大気中CO2濃度（約400 ppm）では、ルビスコはRuBPと酸素の反応も触媒し、2-ホスホグリコール酸と3-PGAをそれぞれ1分子ずつ生成している（Peterhansel and Maurino 2011）。 2-ホスホグリコール酸は、一連の生化学反応を伴う光呼吸と呼ばれるプロセスを通じて、3-PGAに戻される必要がある。 この過程で、それまで固定されていた炭素や窒素が失われ、余分なエネルギーも使わなければならない（Sharpe and Offermann 2013）。
C4 植物は、BSCにおけるRubiscoの局在と活動を制限する機構を発達させた。 MCはBSCのルビスコと細胞間隙のO2との接触を空間的に阻止し、光呼吸によるエネルギー損失を防いでいる。 C4植物による光呼吸の排除は、CO2補償点がほぼゼロと非常に低く、O2濃度の変化に反応せず常に高いカルボキシル化効率（CE）を示すことで証明されている（図4）。 一方、C3植物では、O2濃度が21%から2%に変化すると、補償点が55ppmから30ppmに大きく減少した（表1）。 図4において、CEを(Li et al. 2009)に従って計算したところ、ソルガムのCEはO2濃度の変化に対して有意に変化しなかったが、イネではO2濃度を21％から2％に低下させるとCEに高い有意な向上が見られた（図4および表1）。 ソルガムではCEの増加はわずか6.1%であったが、イネでは細胞間O2濃度が2%に低下すると41.5%になった（Table 1）。 これらのデータは、光呼吸を減少させることによってイネの光合成能力を高め、ひいては収量を大幅に増加させることができる大きな可能性があることを示している。 MCの光呼吸を減少させる一つの方法は、MCのグリシンデカルボキシラーゼ（GDC）タンパク質を減少させ、BSCへの蓄積を制限し、グリシンの脱炭酸がBSCのみで起こるようにすることで、BSCにおいてC3-C4中間体の場合と同様に高い二酸化炭素濃度を生成する（Monson and Rawsthorne 2000）ことである。 C4イネコンソーシアムでは、ZmPEPCプロモーターによって駆動されるイネGDC-Hサブユニットに対して設計された人工マイクロRNAを用いて、このアプローチを検証している（Kajala et al.2011）。 このような生化学的メカニズムでは、イネBSCsの葉緑体数の増加やミトコンドリアなどのオルガネラの充実など、BSCsの細胞特殊化が必要となり、GDCによるグリシンの脱炭酸によって放出されたCO2を再捕捉しやすくなる（Ueno 2011）。 また、光呼吸によって放出されたCO2を光合成の場に回収するアプローチとして、大腸菌の糖質分解経路をシロイヌナズナの葉緑体に移植し、葉緑体中の糖質を直接グリセリン酸に変換することに成功した（Kebeish et al.） シロイヌナズナの光呼吸を減らし、光合成を促進するこの戦略は、グリコール酸デヒドロゲナーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、タルトロンセミカルアルデヒド還元酵素をコードする5つの葉緑体標的細菌遺伝子による段階的核形質転換であり、イネなど他のC3植物にも適用可能だが、C4イネのエンジニアリングには細菌遺伝子を用いることは好まれない可能性がある。
2種類の（21%と2%）O 2レベルにおけるC3およびC4の光合成のレート。 細胞間CO2濃度を0, 20, 50, 100, 200 μmol mol-1に変化させ、3分間隔で光合成速度またはCO2同化率（A）を測定した。 ブロックと葉の温度は28±1℃、相対湿度は68±5％、光量は1500μmol m-2 s-1で一定、流速は400μmol s-1で維持された。
C4 pathway to rice
シングルセルC4システムはC3植物に取り付けるのが早いかもしれないと考えられていた。 イネにも単細胞C4光合成系を工学的に組み込む試みがある（Miyao et al.） ヒドロゲラ（Hydrilla verticillata (L.f) Royle.）で行われているような、MCでCO2を捕捉・放出する単細胞C4様経路を導入するために、経路に関わる4つの酵素（PEPC、PPK、NADP-MDH、NADP-ME）を遺伝子導入イネの葉で過剰生産した（Kuら、1999、深山ら、2001、土田ら、2001、Taniguchiら、2008）。 イネの単細胞C4経路を実現するために解決すべき主な問題点として、PEPの葉緑体包膜を越える輸送活性を促進する機構、OAAを葉緑体に取り込みNADP-ME反応の方向性、NADP-MDHの関与、イネのMC葉緑体の内部に内在性PEPCがありNADP-MDH活性をさらに上昇させる必要があるとの報告があります (Miyao et al. 2011)。 また、Chenopodiaceae に属する Bienertia cycloptera、B. sinuspersici、Suaeda aralocaspica などの陸上単細胞 C4 種も、炭素同化と脱炭酸の空間区画を必要としている (Chuong et al. 2006)。 これらの種は、これらのコンパートメントに二種類の葉緑体を有している。 以前の試みは、解剖学的構造に変化がないこと、適切な輸送体がないこと、イネに形質転換したトウモロコシ遺伝子が細胞特異的に適切に発現せず、トウモロコシのように制御されず、内在性のイネC3アイソフォームのように制御されたことによる、無駄なサイクルを生んだ（Miyao et al. 2011）。
自然界では何百万年もかかる光合成経路を20年以内にC3からC4へと進化させるため、C4イネコンソーシアムはクランツ型の構造を持つC4イネの形成を目指して、既知の遺伝子の発見とイネへの組み込みを同時に開始した。 CA、PEPC、PPDK、NADP-ME、NADP-MDHなどのC4遺伝子をトウモロコシからクローニングし、イネに形質転換した。 また、C4代謝経路で過剰発現しているトランスポーター、例えば、2-オキソグルタル酸/リンゴ酸トランスポーター（OMT1）、ジカルボン酸トランスポーター1（DiT1）、ジカルボン酸トランスポーター2（DiT2）、PEP/リン酸トランスポーター（PPT1）、メソフィルエンベロープ蛋白（MEP）と最近トウモロコシBSとMS細胞のプロテオミックによって特定したトリオース-リン酸トランスロケーター（TPT） (Frisoet al.). 2010）のイネへの形質転換が進められています（図3）。 C4イネコンソーシアムのメンバーは、クランツ解剖学に関連する新規遺伝子の発見にも携わっています（Wang et al.2013b）。 試験された後、クランツ解剖学を制御する有望な候補遺伝子は、C4生化学経路遺伝子を導入したイネにも導入される予定である
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