Abstract
Mechanizmy acetylacji kilku wybranych typowych substratów pochodzących z eksperymentów, w tym arylaminy i arylohydrazyny, są badane za pomocą teorii funkcjonałów gęstości w niniejszej pracy. Wyniki wskazują, że wszystkie stany przejściowe charakteryzują się strukturą pierścienia czteroczłonowego, a hydralazyna (HDZ) jest najsilniejszym substratem. Bioaktywność dla wszystkich związków wzrasta w sekwencji PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ. Efekt koniunkcji i delokalizacji par samotnych atomu N odgrywają kluczową rolę w reakcji. Wszystkie wyniki są zgodne z danymi eksperymentalnymi.
1. Wstęp
N-acetylotransferazy aryloaminowe (NATs, EC 2.3.1.5) są enzymami metabolizmu II fazy występującymi zarówno u prokariotów jak i eukariotów. Reakcja N-acetylacji prowadzi do detoksykacji ksenobiotyków aryloaminowych i ostatecznie kieruje je do elektrofilowych jonów arylnitreniowych, które są uważane za odpowiedzialne za tworzenie adduktów DNA. Do Humans, dwa funkcjonalne izozymy NAT, NAT1 i NAT2, wykazują duże różnice w specyficzności substratowej i dystrybucji tkankowej, pomimo 81% identyczności sekwencji aminokwasowej. Drugi z nich, NAT2, ulega ekspresji głównie w wątrobie i nabłonku jelitowym. Wcześniejsze badania sugerowały, że NAT katalizują transfer acetylu poprzez klasyczny mechanizm kinetyczny ping-pong (schemat 1). Analiza mutagenezy ukierunkowanej na miejsce aktywacji ludzkich NAT2 i NAT Salmonella typhimurium (StNAT) sugerowała, że reszty cysteinowe w miejscu aktywnym są odpowiedzialne za pośredniczenie w procesie acetylacji. Ostatnie badania kinetyczne w stanie ustalonym i ustalonym nad octanem p-nitrofenylu (PNPA) i NAT2 wykazały, że mechanizm katalityczny NAT2 może zależeć od tworzenia się pary tiolan-imidazol. Chociaż enzym ten występuje zarówno u eukariontów, jak i prokariontów, endogenna rola NAT jest nadal niejasna. Oznaczanie substratów ujawniło, że zarówno arylaminy jak i arylohydrazyny mogą być acetylowane przez NATs. Wymagane etapy reakcji acetylotransferu składają się z przeniesienia grupy acetylowej z reszt cysteinowych w miejscu aktywnym do substratu oraz usunięcia jednego protonu z tego ostatniego do pierwszego. W niniejszej pracy przedstawiono szczegółowe badania teoretyczne dotyczące zachowania się substratów aryloaminowych i arylohydrazynowych w acetylacji, w tym właściwości ich struktur, stanów przejściowych, profili energii.
2. Metodologia
Wszystkie obliczenia wykonano metodą funkcjonalnej teorii gęstości (DFT) B3LYP zaimplementowaną w pakiecie programowym Gaussian03 , która została wcześniej z powodzeniem zastosowana do wielu układów enzymatycznych. Gdy zastosowano zestawy bazowe 6-31G* i 6-311+G (3df, 2p), hybrydowa funkcja B3LYP była preferowana w stosunku do metod Hartree-Focka (HF) i MP2. Chociaż czasami zawodzi w traktowaniu oddziaływań bogatych w dyspersję, metoda B3LYP została z powodzeniem zastosowana do wielu układów biologicznych.
Geometrie wszystkich reagentów, produktów pośrednich i końcowych są optymalizowane na poziomie teorii B3LYP/6-31G*. Wyznaczono najbardziej stabilne konformacje, jak również ich energie w każdym stanie równowagi i stanach przejściowych. Dla wszystkich otrzymanych punktów stacjonarnych przeprowadzono obliczenia częstotliwościowe, a każdy stan przejściowy ma tylko jedną częstotliwość urojoną. Ponadto, metoda MP2/6-311+G** jest zastosowana do zoptymalizowanych struktur punktów stacjonarnych w celu uzyskania bardziej dokładnych profili energetycznych. Jeśli nie jest to specjalnie zaznaczone, wszystkie poniższe analizy energetyczne odnoszą się do wyników obliczeń MP2/6-311+G**//B3LYP/6-31G (d).
3. Wyniki i Dyskusja
3.1. The Substrates’ Frontier Obitals
Sześć substratów, kwas p-aminobenzoesowy(PABA), 4-metoksylanilina(4-MA), 4-aminosalicylan(4-AS), 5-aminosalicylan(5-AS), izoniazyd(INZ), hydralazyna(HDZ), zostało wybranych zgodnie z referencjami, które można podzielić na dwie odrębne rodziny: aryloaminy i arylohydrazyny. W tabeli 1 zestawiono energie dla obitali granicznych (w tym HOMO-2, HOMO-1, HOMO, LUMO, LUMO+1 i LUMO+2) wszystkich sześciu substratów, które uważane są za pełniące ważne role w układach bioenzymatycznych. W przypadku aryloamin energie HOMO ulegają obniżeniu w sekwencji 4-MA > 5-AS > PABA > 4-AS, co wskazuje na wzrost ich reaktywności nukleofilowej. Spośród wszystkich sześciu substratów (patrz Rysunek 1 w materiałach dodatkowych dostępnych online pod adresem doi: 10.1155/2009/783035), INZ ma największą lukę energetyczną pomiędzy HOMO i LUMO, co sugeruje jego stabilność. Wyniki Natural Population Analysis (NPA) wykazały, że atomy N aktywnych amin dla rodziny aryloamin są bardziej elektroujemne niż atomy grupy hydrazynowej, co jest spowodowane głównie efektem koniugacji.
W przypadku substratów arylohydrazynowych, samotna para atomów N przy szkielecie pierścienia sześcioczłonowego będzie delokalizowana w całym układzie, co zwiększy jego stabilność. Wartości 𝐸(𝐿-𝐻)dla HDZ są o 0.0318 a.u. wyższe niż dla INZ, co wskazuje na jego wyższą reaktywność niż tego ostatniego.
3.2. Różne ścieżki i stany przejściowe
W zasadzie wszystkie substraty mogą reagować z resztami cysteinowymi w miejscu aktywnym na drodze zgodnej lub stopniowej. W pierwszym przypadku, w stanach przejściowych (patrz Rysunki 1 i 2, przyp. tłum.) dochodzi do zgodnego przeniesienia wodoru H5 na atom S1 cysteiny i utworzenia wiązania pomiędzy atomami N4 i C2. Rozerwanie starych wiązań (N4H5 i S1C2) i utworzenie nowych (C2N4 i S1H5) zachodzi jednocześnie. Reaktanty i produkty docelowe są połączone jedynym stanem przejściowym na powierzchni energii potencjalnej (PES). Główne dane strukturalne wszystkich stanów przejściowych są podane w Tabeli 1 w materiałach uzupełniających. W mechanizmie krokowym, atom H5 zostanie najpierw przeniesiony na atom O3 grupy karbonylowej, co spowoduje wytworzenie nowego wiązania pomiędzy atomem N4 i C2 poprzez stan przejściowy stw-ts1. Następnie powstanie tiolester pośredni (intmed). W konsekwencji, nastąpi druga migracja H5 z grupy hydroksylowej do atomu S1 poprzez stan przejściowy stw-ts2 wraz z rozerwaniem wiązania S1-C2, co ostatecznie doprowadzi do powstania produktów.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Wyniki wskazują, że wszystkie stany przejściowe charakteryzują się strukturą czteroczłonowego pierścienia, który jest prawie planarny. W każdym stanie przejściowym występują dwa małe kąty mniejsze niż 80° (C2S1H5 i S1C2N4 dla con-ts, C2O3H5 i C2N4H5 dla stp-ts1, C2S1H5 i S1C2O3 dla stp-ts2), które wprowadzają duże naprężenia do całego układu i czynią go niestabilnym. Wśród sześciu uzgodnionych stanów przejściowych (con-ts) wszystkich substratów, właściwości wiązania C2N4, N4H5 i S1H5 są mniej więcej takie same dla wszystkich substratów, natomiast oddziaływanie pomiędzy S1 i C2 jest jednym z czynników decydujących o stopniu uzgodnionym.
Inaczej sprawy się mają w przypadku ścieżek krokowych. Zmiany hybrydyzacji atomu C2 wykazują podobną tendencję (𝑠𝑝3→𝑠𝑝2→𝑠𝑝3) dla wszystkich substratów w trakcie acetylowania krokowego (Tabela 1 uzupełniająca). Pierwsza migracja H5 doprowadzi do stanu przejściowego stp-ts1, a następnie na powierzchni energii potencjalnej (PES), będącej lokalnym minimum, zlokalizowany zostanie intermediat o nazwie intmed. Jest to tetraedryczny tiolester pośredni, jak zaproponowano we wcześniejszych badaniach eksperymentalnych. Jest on krótkotrwały i wkrótce nastąpi transfer H5 poprzez stan przejściowy stp-ts2. W przypadku ścieżki stopniowej, struktury stanów przejściowych dla różnych substratów różnią się bardzo nieznacznie od innych. Struktury 3D stanów przejściowych zostały wymienione dla PABA (Rysunek 2), pozostałe były podobne do tych.
3.3. Energie
Względne energie wszystkich możliwych ścieżek dla sześciu substratów zostały przeprowadzone w oparciu o sumę energii reagentów przyjętą jako zero (Rysunek 3). Z Rysunku 3 wynika, że ścieżki uzgodnione są preferowane w stosunku do ścieżek krokowych. Bariery energetyczne zgodnych stanów przejściowych (con-ts) są niższe niż stopniowych (stp-ts1) w zakresie od 83.5 kJ/mol do 26.9 kJ/mol (Tabela 2 uzupełniająca). Arylohydrazyny są lepszymi substratami niż arylaminy, a HDZ jest najbardziej reaktywną substancją o najniższej energii aktywacji, co jest zgodne z danymi eksperymentalnymi. Wniosek ten można również wyciągnąć z analizy danych strukturalnych (Tabela 1, uzupełnienie). Wzmocniony efekt koniunkcji i delokalizacji samotnych par azotu przy szkielecie stabilizuje stan przejściowy. Bioaktywność dla wszystkich substratów jest zwiększona w sekwencji PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ.
4. Wnioski
Można wyciągnąć następujące wnioski.Podziękowania
Ta praca była wspierana przez National Natural Scientific Foundation of China (no.20603030, no.20873074, and no.10674114), 973 projekt Ministerstwa Nauki i Technologii Chin (nr 2009CB930103), Natural Scientific Foundation of Shandong Province (nr Q2008B07) oraz Foundation for Creative Research Groups of Ludong University (nr 08-CXA001).
Materiały uzupełniające
Ze względu na ograniczenie długości niniejszej pracy, struktury 3D wszystkich aryloamin i substratów arylohydrazynowych, dane dotyczące struktury głównej wszystkich stanów przejściowych oraz względne energie dla różnych ścieżek zostały zebrane w materiałach uzupełniających.
- Materiały uzupełniające
.