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Introdução

Para fornecer alimentação e nutrição adequadas à população global que se espera que atinja 9 bilhões até 2050 (http://www.unpopulation.org), a produção de arroz precisa aumentar pelo menos 60% (FAO 2009). O arroz é o alimento básico de mais da metade da população mundial e esta população consumidora de arroz está aumentando à taxa de 1,098% ao ano (http://esa.un.org/wpp/Excel-Data/population.htm). Escalar a população significa mais demanda por alimentos, água e terra num momento em que a base de recursos naturais para a agricultura está sendo degradada porque grandes áreas de terras agrícolas estão sendo desviadas da produção de alimentos para a industrialização e produção de biocombustível. Uma mudança climática imprevisível ameaça reduzir ainda mais a terra viável para a agricultura devido a mais casos de seca e inundações (http://www.fao.org/docrep/017/aq191e/aq191e.pdf). Como uma população crescente e as mudanças climáticas globais pressionam cada vez mais o abastecimento mundial de alimentos, é essencial que continuemos a melhorar o desempenho das culturas em termos de produtividade dos grãos para acompanhar o crescimento populacional. O aumento da produtividade das culturas conferido pelos tipos de plantas criados durante o período da revolução verde apoiou o boom populacional que se seguiu às duas guerras mundiais. Desde então, apesar da utilização de variedades melhoradas e tecnologias avançadas, o potencial de rendimento das actuais cultivares de arroz melhorou apenas um pouco, indicando que estas variedades atingiram um limite máximo de rendimento (Akita 1994). Recentemente está em andamento uma tentativa de aumentar o potencial de produção de arroz através da engenharia de uma eficiente fotossíntese do tipo C4 no arroz (Kajala et al. 2011). Para isso, um conjunto de genes que regulam a anatomia das folhas e os processos bioquímicos têm que ser inseridos no arroz e expressos de forma apropriada, o que atualmente não é possível apenas pelas técnicas convencionais de cultivo de plantas. Portanto, a engenharia genética para melhorar a via fotossintética do arroz proporcionaria oportunidades suficientes para aumentar a produtividade real dos grãos, assim como o potencial de rendimento. A engenharia genética fornece uma ferramenta de melhoramento genético eficiente e precisa na qual apenas os genes de interesse podem ser introduzidos mesmo de espécies distantes.

Em plantas C3 como o arroz, o CO2 é assimilado em um composto de 3-carbono pela enzima fotossintética ribulose-1, 5-bisfosfato carboxilase oxigenase (Rubisco). Como o nome indica, a Rubisco também catalisa a oxidação da ribulose-1, 5-bisfosfato (RuBP) num processo de desperdício conhecido como fotorrespiração que pode incorrer numa perda de até 25% de carbono previamente fixado (Sage 2004). A temperatura acima de 30°C, típica das áreas de cultivo de arroz tropical do mundo, a taxa de oxigenação aumenta substancialmente e isso reduz consideravelmente a eficiência fotossintética das plantas C3 em até 40% (Ehleringer e Monson 1993). Assim, a fotossíntese do arroz nos trópicos e nas regiões temperadas quentes torna-se ineficiente. As plantas C4 que têm mecanismo de concentração de CO2 dentro de suas folhas têm níveis muito reduzidos de fotorrespiração e assim evoluíram para prosperar em ambientes quentes e áridos e oferecem valiosos insights para estratégias de melhoramento de culturas. O arroz com um mecanismo de fotossíntese C4 teria aumentado a eficiência fotossintética enquanto usava recursos escassos como terra, água e fertilizante especificamente nitrogênio de forma mais eficaz (Hibberd et al. 2008). Como terá um bom desempenho sob altas temperaturas, bem como exigirá menos água e nitrogênio, o arroz C4 conferiria benefícios a diferentes tipos de ecossistemas de arroz, incluindo as terras marginais.

C4 tipo fotossíntese é um dos três tipos de mecanismos bioquímicos adotados pelas plantas para fixar o CO2 atmosférico, sendo outros caminhos C3 e o metabolismo de ácido Crassulaceano (CAM). A fotossíntese tipo C4 evoluiu mais de 66 vezes independentemente (Sage et al. 2012) pelo menos em 19 famílias durante a evolução do angiospermas dos ancestrais C3 (Muhaidat et al. 2007) e envolve alternância de estruturas celulares, bioquímica e, portanto, o desenvolvimento das folhas. Esta forma altamente especializada de fotossíntese desenvolveu essencialmente um mecanismo de concentração de CO2 em torno da enzima Rubisco, eliminando assim a função oxigenase do Rubisco, reduzindo assim o desperdício de energia devido à fotorrespiração (Douce e Heldt 2000). O Rubisco das espécies C4 é mais eficiente do que o das espécies C3 em termos de carboxilação (Kubien et al. 2008). Os outros benefícios associados ao sistema C4 incluem maior eficiência no uso da água, porque o gradiente de concentração mais acentuado para a difusão de CO2 pode ser mantido através de estomas parcialmente fechados, maior eficiência no uso de radiação, já que a eficiência da fotossíntese C4 não se satura com alta intensidade de luz (Rizal et al. 2012) e maiores eficiências no uso de nitrogênio, já que exigirá menos Rubisco e, portanto, menos nitrogênio.

C4 as plantas são potencialmente mais produtivas a temperaturas mais altas, tipicamente experimentadas pelo arroz. Para tirar proveito deste sistema fotossintético mais eficiente numa altura em que a população e os preços dos alimentos estão em alta, há esforços no sentido de inserir o mecanismo C4 tal como o encontrado no milho no arroz (Rizal et al. 2012). Esta nova abordagem para modificar o sistema fotossintético do arroz é um esforço desafiador e de longo prazo porque o caminho do C4 é muito complexo e muitos fatores que controlam o mecanismo ainda são desconhecidos. Portanto, requer engenhosidade e experiência de cientistas envolvidos em diversas disciplinas, como engenharia genética, bioquímica, bioinformática, biologia molecular, fotossíntese, biologia de sistemas, fisiologia, melhoramento vegetal, metabologia, etc. Para o mesmo, o consórcio de arroz C4 foi conceituado e estabelecido, o qual iniciou o trabalho prático da engenharia do arroz C4 desde 2009 (http://photosynthome.irri.org/C4rice/). Esta revisão fornece uma atualização sobre os requisitos para desenvolver o arroz C4 e os progressos feitos no campo da engenharia genética. Com base no estudo da evolução do arroz C4 a partir das espécies C3 e das mudanças associadas, as seguintes modificações são essenciais para estabelecer uma via fotossintética funcional C4 no arroz.

Incrementar o número e tamanho dos cloroplastos nas células da bainha do arroz

No arroz mais de 90% do total de cloroplastos estão localizados em células mesofílicas (MCs) dentro da folha (Yoshimura et al. 2004); enquanto que nas plantas C4 tanto as MCs como as células da bainha do feixe (BSCs) possuem igual número de cloroplastos (Figura 1A e B). Isto porque, em plantas C3, todo o processo de fotossíntese ocorre em MC, mas em plantas C4 o processo de fotossíntese é compartimentado em MC e BSC. Os MCs realizam a primeira fixação de CO2 na qual se forma o composto de 4-carbono chamado oxaloacetato e este é convertido em ácidos C4, como o malato, que são transportados em BSCs, permitindo assim uma assimilação eficiente de CO2 em carboidratos pelo ciclo de Calvin em BSCs. Portanto, ao contrário das plantas C3, os BSCs das plantas C4 têm funções fotossintéticas como a descarboxilação do composto C4 e o processo do ciclo de Calvin. Para realizar estes processos, os BSCs das plantas C4 são ampliados e possuem mais cloroplastos, tornando assim os BSCs mais pronunciados e fotossinteticamente ativos. As BSCs na espécie C3 funcionam para equilibrar a pressão hidráulica, evitar a entrada de ar dos espaços intercelulares para o xilema, fornecer um reservatório de água para amortecer perdas por transpiração, permitir a entrada e dispersão de maior intensidade de luz que atinge as veias na folha (Nikolopoulos et al. 2002). Outras funções dos BSCs das plantas C3 incluem o transporte de nitrogênio, enxofre, carboidratos e o papel na via de sinalização que foi amplamente revisada em (Leegood 2008). Nas espécies C4, BSCs e MCs cooperam numa versão em duas etapas da fotossíntese. Como resultado, para assegurar um contacto directo entre BSCs e MCs, as plantas C4 possuem um tipo especial de anatomia foliar acompanhada pela proliferação de cloroplastos em BSCs. Para introduzir a via C4 no arroz, são necessários mais cloroplastos fotossintéticos nos BSCs do que o arroz tem agora. Isso poderia ser feito expressando em excesso os elementos genéticos necessários para o desenvolvimento do cloroplasto, como os genes do tipo Golden2 (GLK) de uma maneira específica para as células, usando promotores de genes C4 como a carboxilase piruvada de fosfenol (PEPC) de Zea mays para expressão específica de MC e o promotor de carboxilase piruvada de fosfenol (PCK) de Zoysia japonica para expressão específica de BSC em folhas de arroz (Matsuoka et al. 1994; Nomura et al. 2005).

Golden2-like (GLK) os membros da família genética codificam fatores de transcrição nuclear que têm sido implicados para regular o desenvolvimento de cloroplastos em Arabidopsis, Zea mays, e os patens Physcomitrella moss (Rossini et al. 2001). Em cada uma dessas espécies, os genes GLK existem como um par homólogo chamado GLK1 e GLK2 (Waters et al. 2009). Em musgo e Arabidopsis os genes GLK são redundantes e funcionalmente equivalentes enquanto que no milho e no sorgo os genes GLK actuam de uma forma específica do tipo celular para direccionar o desenvolvimento de cloroplastos dimórficos (Waters et al. 2008; Wang et al. 2013a). No milho, Golden2 (G2) e seu homólogo ZmGLK1 transcrições acumulam principalmente em células BS e M, respectivamente, sugerindo um papel específico para cada gene que regula a diferenciação dos cloroplastos dimórficos (Wang et al. 2013a).

Reduzir o espaçamento das veias aumentando assim a densidade das veias na folha

Na espécie C3, a fotossíntese ocorre nos MCs. Altos números de MCs entre as veias consecutivas (Figura 1A) empurram as veias para longe umas das outras, aumentando assim o espaçamento das veias ou reduzindo a densidade das veias. Nas folhas de arroz há menos de 6 veias por mm (Figura 2A), Setaria viridis e sorgo (ambas são espécies típicas C4) têm mais de 7 veias por mm (Figura 2B e C). As folhas C4 têm em média 2 MCs entre os veios (Figura 1B). A maior densidade de veias nas folhas das plantas C4 leva a uma proporção de quase um para um dos volumes de tecidos M e BS. A anatomia interna de uma folha C4 é frequentemente composta por um padrão de repetição de veias-BS-M-M-BS-veína. BSCs circundadas por MCs formam uma estrutura semelhante a uma coroa; este tipo de anatomia foliar foi chamado de “anatomia Kranz” pelo botânico alemão G. Haberlandt. As C4 BSCs têm citoplasma denso e são preenchidas com grandes números de cloroplastos (Figura 1B). Para o funcionamento eficiente da via C4, um contato próximo entre as células M e BS é indispensável e estas estão estreitamente interligadas entre si com grandes números de plasmodesmados Dengler e (Nelson 1999). A anatomia Kranz é encontrada com pouca variação em quase todas as linhagens monocotiledôneas e dicotiledôneas que usam o modo de duas células da via fotossintética C4. Estudos sobre anatomia e morfologia das folhas revelaram vários genes responsáveis pelo crescimento, desenvolvimento ou deformidades das células das folhas. Um gene ACAULIS1 foi responsável pelo alongamento das células da folha (Tsukaya et al. 1993). Mutação no gene CURLEY LEAF (CLF) produziu folhas enroladas em Arabidopsis (Kim et al. 1998). O aumento no final da veia livre, padrão de venação aberta e estrutura foliar arredondada foram causados pela rotunda 1 (RON1) (Robles et al. 2010). Mutação no gene do espantalho no milho mostrou aumento no número de BSCs, diferenciação incomum do cloroplasto BS, diminuição nas veias menores e alteração na densidade das veias (Slewinski et al. 2012). Estes estudos relacionados com a patterização anormal das veias causada pela mutação de genes particulares fornecem alguma pista sobre como a anatomia de Kranz é regulada e sugerem o envolvimento de múltiplas vias no desenvolvimento do padrão de Kranz. A rede reguladora SCARECROW/SHORTROOT foi determinada como sendo um dos componentes importantes necessários para a padronização da anatomia de Kranz porque as folhas das plantas C3 com o gene do espantalho mutado eram normais, enquanto que nas plantas C4 a mutação no mesmo gene danificou a anatomia de Kranz (Slewinski et al. 2012; Wang et al. 2013b). Recentemente, foi demonstrado que a introdução de cromossomos de milho em aveia poderia aumentar o tamanho do BSC e reduzir o espaçamento das veias nas folhas de aveia C3 demonstrando que a anatomia da folha C3 pode ser modificada (Tolley et al. 2012). Além disso, um grande esforço foi feito para selecionar mutantes de sorgo (C4) com maior espaçamento entre as veias e mutantes de arroz (C3) com espaçamento entre as veias reduzido para que os genes que controlam o espaçamento entre as veias possam ser identificados (Rizal et al. 2012).

A atividade do ciclo de Calvin deve ser significativamente reduzida em MC e muito aumentada em BSC de arroz

A fotossíntese de C4 é caracterizada por um mecanismo bioquímico de bombeamento de CO2 que eleva a concentração de CO2 no local de Rubisco. Um alto nível de CO2 em torno de Rubisco reduz a taxa de fotorrespiração e aumenta a assimilação de CO2 líquido levando a uma fotossíntese altamente eficiente Weber e von (Caemmerer 2010). Para conseguir isso, a assimilação de CO2 em C4 é distribuída por dois tipos de células, os MCs e os BSCs (Figura 3). Portanto, a fixação do carbono C4 depende da expressão e localização do gene específico da célula. As células BS e M fotossinteticamente ativas vizinhas interagem para eliminar a fixação de O2 catalisada por Rubisco. Em plantas bi-celulares do tipo C4, o CO2 é inicialmente fixado no ácido C4 denominado oxaloacetato em MCs por uma carboxilase insensível a O2 chamada fosfenoenol piruvato de carboxilase (PEPC, EC 4.1.1.31). O oxaloacetato é então convertido em malato ou aspartato e é transportado para BSCs onde é descarboxilado e o CO2 é liberado. Este CO2 é refixado por Rubisco e todas as atividades subsequentes do ciclo Calvin ocorrem em cloroplasto de BSCs (Nelson e Langdale 1989). Consequentemente, para fazer funcionar o arroz C4, a atividade de Rubisco tem que ser muito reduzida em MCs e aumentada em BSCs, que então confina o ciclo de Calvin aos BSCs do arroz, como em um sistema C4. Por outro lado, certos genes que codificam as enzimas C4, como β anidrase carbónica (CA) e PEPC, têm de ser sobreexpressos em citosol de MCs de arroz, de modo a facilitar a fixação primária de CO2 para que o CO2 possa ser concentrado e fornecido à Rubisco nos BSCs. O ciclo C4 também envolve o transporte extensivo de metabólitos através da membrana do envelope cloroplástico e plasmalemma de MC e BSC (Figura 3). Como tal, além das enzimas principais C4 nomeadamente CA, PEPC, ortofosfato piruvado (Pi) dikinase (PPDK, EC 2.7.9.1), malato desidrogenase dependente de NADP (NADP-MDH, EC 1.1.1.82) e enzima málica dependente de NADP (NADP-ME, EC 1.1.1.40), a via C4 também requer a inserção de transportadores de metabólitos para oxaloacetato, malato, triose-fosfato e piruvato no arroz para fornecer maior capacidade de transporte para os intermediários do ciclo C4, para que o ciclo Calvin possa funcionar efetivamente nos BSCs (Weber e von Caemmerer 2010).

A fotorrespiração em células mesofílicas tem de ser muito reduzida

Em plantas C3 a fixação de carbono e o ciclo Calvin ocorrem em MCs. Durante a fixação do carbono, a ribulose-1,5-bisfosfato (RuBP) – um composto de cinco átomos de carbono, catalisado por uma enzima ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase oxigenase (Rubisco, EC.4.1.1.39) reage com CO2 para formar duas moléculas de composto de 3-carbono chamado 3-fosfoglicerato (3-PGA). Dentro do ciclo Calvin, as duas moléculas de PGA formam uma molécula rica em energia de açúcar (triose fosfato) e regenera RuBP para o ciclo seguinte. Nas concentrações atmosféricas atuais de CO2 (ca. 400 ppm), a Rubisco também catalisa uma reação entre RuBP e O2 resultando em uma molécula de 2-fosfoglicolato e 3-PGA (Peterhansel e Maurino 2011). O 2-fosfoglicolato tem que ser convertido de volta para 3-PGA através do processo chamado fotorrespiração, que envolve uma série de reações bioquímicas. Durante este processo ocorre uma perda de carbono e nitrogênio previamente fixado e também deve ser utilizada energia extra (Sharpe e Offermann 2013).

C4 plantas desenvolveram mecanismos para restringir a localização e as atividades da Rubisco nos BSCs. Os MCs impedem espacialmente o contato entre Rubisco nos BSCs e O2 nos espaços intercelulares, evitando assim a perda de energia através da fotorrespiração. A eliminação da fotorrespiração pelas plantas C4 é evidenciada pelo seu ponto de compensação de CO2 muito baixo, que é quase nulo e constantemente alta eficiência de carboxilação (EC) sem responder às mudanças nas concentrações de O2 (Figura 4). Em contraste, nas plantas C3, com a mudança na concentração de O2 de 21% para 2%, o ponto de compensação diminuiu significativamente de 55 para 30 ppm (Tabela 1). Na Figura 4, a EC foi calculada de acordo com (Li et al. 2009) que mostrou que a EC de sorgo não mudou significativamente com a mudança no nível de O2, mas no arroz houve uma melhora altamente significativa na EC quando o nível de O2 diminuiu de 21 para 2% (Figura 4 e Tabela 1). O aumento da EC no sorgo foi de apenas 6,1% enquanto que no arroz foi de 41,5% com a diminuição da concentração intercelular de O2 para 2% (Tabela 1). Estes dados mostram que existe um grande potencial para aumentar a capacidade fotossintética do arroz diminuindo a fotossintética, o que, por sua vez, aumentaria substancialmente o rendimento. Uma maneira de reduzir a fotorrespiração em MC é reduzindo a proteína descarboxilase da glicina (GDC) em MC e restringindo seu acúmulo em BSC de modo que a descarboxilação da glicina ocorra exclusivamente em BSC, gerando assim maior concentração de CO2 em BSC, semelhante à dos intermediários C3-C4 (Monson e Rawsthorne 2000). O consórcio de arroz C4 está testando esta abordagem usando microRNA artificial projetado contra a subunidade GDC-H de arroz, que é dirigida pelo promotor ZmPEPC (Kajala et al. 2011). Tal mecanismo bioquímico requer uma especialização celular dos BSCs que inclui um aumento do número de cloroplastos e mitocôndrias enriquecendo o conteúdo organelizado dos BSCs do arroz para ajudar na recaptura do CO2 liberado pela descarboxilação da glicina pelo GDC (Ueno 2011). Outra abordagem bem sucedida para capturar o CO2 liberado pela fotorrespiração para o local da fotossíntese é a transferência da via catabólica do glicolato de Escherichia coli para cloroplastos de Arabidopsis thaliana em que o glicolato em cloroplasto foi diretamente convertido em glicerato (Kebeish et al. 2007). Esta estratégia que reduziu a fotorrespiração e melhorou a fotossíntese na Arabidopsis envolveu uma transformação nuclear por etapas com cinco genes bacterianos alvo do cloroplasto que codificam a glicolato desidrogenase, a carboligase glioxilada e a semialdeído redutase tartrônica poderiam ser aplicados a outras plantas C3 como o arroz, no entanto, o uso de genes bacterianos pode não ser preferível na engenharia do arroz C4.

Engenharia do caminho C4 para o arroz

Pensava-se que o sistema de célula única C4 poderia ser mais rápido de instalar em plantas C3. Há tentativas de engendrar o sistema de fotossíntese C4 de célula única também no arroz (Miyao et al. 2011). Para introduzir o caminho de célula única do tipo C4 no qual o MC é feito para capturar e liberar CO2 da forma como ocorre em Hydrilla verticillata (L.f) Royle., quatro enzimas (PEPC, PPDK, NADP-MDH, e NADP-ME) envolvidas no caminho foram produzidas em excesso nas folhas transgênicas de arroz (Ku et al. 1999; Fukayama et al. 2001; Tsuchida et al. 2001; Taniguchi et al. 2008). Alguns dos principais problemas encontrados que precisam ser resolvidos para fazer um caminho do tipo C4 de célula única no arroz são: mecanismo para facilitar a atividade de transporte de PEP através do envelope cloroplástico, a importação de OAA para os cloroplastos e a direção da reação NADP-ME, envolvimento do NADP-MDH, presença de PEPC endógeno dentro do cloroplástico MC do arroz e elevação da atividade NADP-MDH foram relatados como necessários (Miyao et al. 2011). Espécies C4 terrestres de célula única como Bienertia cycloptera, B. sinuspersici e Suaeda aralocaspica, pertencentes à família Chenopodiaceae, também necessitam de compartimentação espacial da assimilação de carbono e descarboxilação (Chuong et al. 2006). Estas espécies possuem cloroplastos dimórficos nesses compartimentos. As tentativas anteriores produziram um ciclo fútil que se deveu a nenhuma alteração na anatomia, falta de transportadores apropriados e os genes do milho transformado em arroz não foram adequadamente expressos de forma específica e não foram regulados como no milho, mas foram regulados como as isoformas endógenas do arroz C3 (Miyao et al. 2011).

Para engendrar a via fotossintética de C3 a C4 em duas décadas, o que levou milhões de anos na natureza, o consórcio de arroz C4 iniciou a descoberta e engenharia simultânea de genes já conhecidos em arroz com o objetivo de formar arroz C4 com anatomia do tipo Kranz. Genes C4 como CA, PEPC, PPDK, NADP-ME e NADP-MDH são clonados a partir do milho e transformados em arroz. Também os transportadores que foram sobre expressados nas vias metabólicas C4 como o transportador de 2-oxoglutarato/malato (OMT1), o transportador de dicarboxilato1 (DiT1), o transportador de dicarboxilato2 (DiT2), o transportador de PEP/fosfato (PPT1), a proteína do envelope de mesofila (MEP) e o translocador de fosfato de triose-fosfato (TPT) que foram recentemente identificados através da proteômica das células BS e MS do milho (Friso et al. 2010) estão sendo transformados em arroz (Figura 3). Os membros do consórcio do arroz C4 também estão envolvidos na descoberta de novos genes relacionados com a anatomia de Kranz (Wang et al. 2013b). Uma vez testados, os genes candidatos promissores que controlam a anatomia de Kranz também serão introduzidos nas plantas de arroz que foram projetadas com os genes da via bioquímica C4.