3.1.2 Azides
Azide é considerado como um dos grupos mais adequados para reacções bioorthogonais e para fins de química do clique. Em contraste com a cetona e o aldeído, quase não existem azidas nos sistemas biológicos. As azidas possuem uma energia altamente intrínseca mas não têm parceiro de reacção natural (King e Wagner, 2014), têm tamanhos pequenos e carga global neutra e, finalmente, são cinicamente estáveis sob condições fisiológicas.
A ligação Staudinger (Staudinger e Hauser, 1921) parece ser um bom candidato para reacções de bioconjugação usando azidas. Nesta reação, as azidas reagem com reagentes de trifenilfosfina contendo uma armadilha eletrofílica para produzir um intermediário aza-ilida que reage com o grupo éster carbonilo eletrofílico formando um anel de cinco membros que sofre hidrólise para gerar uma ligação amida estável final (Fig. 5.6A) (Steen Redeker et al., 2013; Staudinger e Hauser, 1921). Uma nova variante desta reação foi descrita logo após (King e Wagner, 2014; Saxon e Bertozzi, 2000; Saxon et al., 2000; Nilsson et al., 2000), referida como “ligação Staudinger sem traço”, onde o produto final, ligado entre si, é liberado da meada de óxido de fosfina.
Figure 5.6. Exemplos de reacções de bioconjugação com azidas. (A) ligação de Staudinger; (B) cicatrização com azida catalizada de cobre; (C) cicatrização com estirpe de azida catalizada; (D) cicatrização com oxanorbornadienes. UAA, aminoácidos não naturais.
A ligação Staudinger tem sido empregada em uma variedade de aplicações. Por exemplo, Raines et al. aplicaram esta reação como alternativa livre de cisteína à NCL para a ligação de peptídeos (Nilsson et al., 2001) e em combinação com NCL na montagem de RNAase A artificial (Nilsson et al., 2005). Além disso, foi utilizada em outras aplicações, como a imobilização de proteínas em suporte sólido para imagens in vitro e in vivo (Saxon e Bertozzi, 2000; Prescher et al., 2004), rotulagem de biomoléculas in vitro e in vivo (Saxon e Bertozzi, 2000; Prescher et al, 2004; Vocadlo et al., 2003), enriquecimento de proteínas (Vocadlo et al., 2003) e detecção (Charron et al., 2009), bem como (Lemieux et al., 2003) modificação de proteínas.
Nonetheless, the Staudinger ligation has some drawbacks. Nomeadamente, a sua cinética lenta (constante de segunda ordem na faixa baixa de 10-3 M-1s-1) (Lin et al.., 2005), a capacidade de oxidação dos compostos de fosfina (necessidade de usar concentrações relativamente altas do reagente fosfina), e o potencial de reactividade cruzada das fosfinas com os dissulfetos (Lang e Chin, 2014; King e Wagner, 2014).
Azidas podem reagir com alcinos em uma cicloadição cu(I)-catalítica azida-alquídica (CuAAC) ou 1,3-dipolar (Fig. 5.6B), um dos exemplos mais padronizados de reações químicas de clique (Rostovtsev et al., 2002; Tornøe et al., 2002). Esta reação apresenta alto interesse em ciências biológicas devido à sua boa seletividade, alto rendimento e condições de reação suaves (temperatura ambiente em vários solventes). Adicionalmente, tanto as azidas como os alcinos são introduzidos nas proteínas sem afectar a estrutura e função da proteína (Steen Redeker et al., 2013). A azida e o alquino podem formar muito rapidamente uma ligação estável de 1,2,3-triazóis em condições fisiológicas, na presença de Cu(I). O mecanismo proposto por Sharpless et al. (Rostovtsev et al., 2002) descreve primeiramente a introdução do alquino terminal em uma acetilida de cobre e um ataque posterior da azida (King e Wagner, 2014). Recentemente, este mecanismo foi aperfeiçoado e um intermediário dicopper foi proposto (Worrell et al., 2013). Os principais inconvenientes desta reacção são as reacções laterais dependentes do Cu(I)e a citotoxicidade do Cu(I) (Baskin et al., 2007; Plass et al., 2011), que têm limitado a sua aplicação principalmente para a rotulagem no espaço extracelular (King e Wagner, 2014). O CuAAC tem sido amplamente utilizado em muitos estudos biológicos diferentes, por exemplo, para rotular os fosfolípidos para sua imagem in vivo (Jao et al., 2009) e in vitro (Neef e Schultz, 2009), para remodelação da superfície do vírus (Steinmetz et al, 2009), para modificar/ rotular proteínas in vitro e in vivo (Link e Tirrell, 2003; Ngo e Tirrell, 2011; Liu e Schultz, 2010; Deiters et al., 2003), para rotular ácidos nucléicos (Weisbrod e Marx, 2008), e perfis de sondas baseados em afinidade (Speers et al., 2003).
A abordagem diferente foi desenvolvida para superar a citotoxicidade do cobre. Nomeadamente, o uso de ligantes solúveis em água para coordenação de Cu(I), o uso de azidas orgânicas de cobre e a introdução de estirpes de anéis na meada alquídica. No primeiro caso, os ligantes solúveis em água coordenam o Cu(I) para formar um catalisador de cobre ativado capaz de promover o CuAAC em baixas concentrações micromolares de metal, reduzindo ao mesmo tempo a toxicidade potencial do Cu(I) (Besanceney-Webler et al., 2011; Del Amo e Wang, 2010; Hong et al., 2009; Kennedy et al., 2011). No segundo caso, a concentração efetiva de Cu(I) é aumentada no local de reação usando ligantes azidas contendo uma moleza interna de cobre (Brotherton et al., 2009; Kuang et al., 2010; Uttamapinant et al., 2012). A estratégia final envolve o uso de alcinos, que foram ativados para reagir com uma cinética melhorada na ausência de catalisador. A este respeito, o uso de ciclooctyne moieties aumenta a reatividade como resultado da liberação de anéis de tensão (Steen Redeker et al., 2013; Baskin et al., 2007; Plass et al., 2011). A ciclodição azida-alquídica propromocionada (SPAAC) (Fig. 5.6C) tornou-se uma ferramenta poderosa não só para a rotulagem de proteínas e anticorpos, mas também para outras aplicações como a análise Western Blot livre de anticorpos (Boutureira et al., 2015) porque não são necessários reagentes adicionais ou metais tóxicos que possam danificar biomoléculas. Por exemplo, Bertozzi et al. provaram a sua aplicabilidade na modificação de proteínas purificadas (Baskin et al., 2007). Em outras experiências, a reação foi aplicada com sucesso in vitro às células fibroblásticas (Baskin et al., 2007). Além disso, o SPAAC foi utilizado para a imagem de tumores em ratos vivos com a ajuda de nanopartículas (Koo et al., 2012) e 18F PET, onde o flúor foi ligado tanto à azida como à cicloalquina (Jeon et al., 2012). Outros campos de aplicação foram encontrados na modificação de vírus e etiquetagem de DNA (Qiu et al., 2013). No entanto, a síntese complexa de ciclooctynes e os fatos de que sua maior quantidade e hidrofobicidade podem afetar a estrutura e estabilidade proteica (Kim et al.., 2013), e o seu aumento de activação pode promover reacções laterais com tióis naturais podem ser considerados como desvantagens.
As azidas sulfonil-deficientes em electrões também podem reagir com alcenos activados (oxanorbornadienes ou norbornenes) numa cicloadição sem metal (Fig. 5.6D), semelhante à SPAAC (Alder, 1930; Huisgen et al., 1980). No entanto, o produto das cícloadias azide-alkene é uma triazolina relativamente instável, ao contrário dos triazóis aromáticos formados na clássica cícloadição por clique. Um oxanorbornadieno que é ao mesmo tempo tenso e deficiente em electrões foi utilizado como dipolarófilo numa reacção com azidas (van Berkel et al., 2008). Neste caso, a dupla ligação tensa em oxanorbornadieno reage com as azidas para formar uma triazolina intermediária que espontaneamente sofre uma reação retro Diels-Alder, com liberação de furano, levando a 1,2,3- ou 1,4,5-triazóis estáveis. Esta reação foi utilizada para bioconjugar seletivamente uma proteína oxanorbornadieno-funcionalizada e um peptídeo cíclico modificado com azida em tampões aquosos. Embora os oxanorbornadienes sejam mais fáceis de sintetizar do que os seus equivalentes ciclooctíneos, esta reacção de cicloadição é bastante lenta e não inteiramente quimiose-colectiva em relação a outros grupos funcionais encontrados nas proteínas, o que pode ter limitado a sua utilização generalizada (Lang e Chin, 2014; van Berkel et al., 2008).