1 INTRODUÇÃO
Bilayer membranas fosfolipídicas (BLM’s) representam um sistema modelo útil para examinar aspectos fundamentais dos componentes do bílis lipídico das membranas celulares biológicas e, particularmente, para investigar suas propriedades elásticas. São estruturas auto-montadas de moléculas anfípticas com características físicas muito semelhantes às dos cristais líquidos esmecêuticos. A matriz do bílis lipídico é capaz de incorporar moléculas hidrofóbicas e anfhipáticas como proteínas, outros lipídios, peptídeos, esteróides e cosurfactantes. As propriedades elásticas das membranas lipídicas consideradas como meios contínuos têm sido utilizadas em uma variedade de estudos que vão desde fenômenos locais, como as interações lipídio-lípidos, lipoproteínas e proteínas-proteínas, até as flutuações das células inteiras. Além disso, a natureza líquida dos hidrocarbonetos do bico é mantida por interações intermoleculares entre os fosfolípidos em escala nanoscópica: interações eletrostáticas e dipolo/dipolo entre os grupos de cabeça polar, interações mediadas por moléculas de água e interações de dispersão van der Waals entre cadeias de hidrocarbonetos .
As superfícies de um BLM não são perfeitamente planas nem rígidas . O sistema BLM é uma estrutura flexível quase bidimensional que sofre continuamente uma variedade de transições conformacionais e dinâmicas . Além disso, os BLMs artificiais e naturais não são sistemas isolantes, mas permeáveis à água e eletrólitos que se difundem através de uma diversidade de poros transmembrana.
Os poros transmembrana estocásticos são gerados por um dos seguintes mecanismos: flutuações térmicas aleatórias e tendenciosas (termoporação), e gatilhos elétricos (eletroporação). As moléculas lipídicas dentro do BLM seguem três categorias distintas de movimentos térmicos aleatórios: translações laterais, paralelas à superfície do bico, com coeficiente de difusão lateral na ordem de 10-7 m2s-1 (Dl) , oscilações e rotações em torno dos eixos lipídicos perpendiculares à superfície do bico .
La translações laterais com direções aleatórias induzem flutuações locais da densidade dos grupos de cabeças polares lipídicas nas superfícies do bico. Portanto, um instantâneo da superfície do bico revela domínios locais de dimensão nanoscópica com maior densidade de grupos de cabeças polares (isto é, clusters), bem como zonas com menor densidade. Para certas condições físicas de BLM (pH, temperatura, componentes lipídicos, potencial eletroquímico, etc.), estas últimas zonas representam pequenos defeitos locais (ou seja, vagas) da membrana. Nesses domínios, as moléculas de água podem penetrar na matriz hidrofóbica do bocal. Consideremos o caso de dois defeitos independentes de cada monocamada que estão alinhados em uma direção perpendicular na superfície da membrana. Elas podem gerar um poro hidrofóbico cilíndrico com a superfície interna flanqueada pelas cadeias hidrofóbicas dos lipídios. Portanto, estes tipos de poros transitórios são de natureza hidrofóbica. Também é possível que os grupos de cabeças polares, situados na proximidade de um poro hidrofóbico, obedeçam a rotações em direção ao seu interior. Neste caso, a superfície hidrofóbica interna dos poros será revestida com grupos de cabeça polares. Assim, estes poros têm uma natureza hidrofílica, não têm mais geometria cilíndrica e têm mais estabilidade que os hidrófobos. Em outras palavras, as flutuações térmicas aleatórias da densidade do grupo de cabeças polares nas duas monocamadas de BLM são capazes de gerar poros transmembrana estocástica.
A presença de flutuações de espessura hidrofóbica dentro do BLM foi demonstrada tanto pela teoria como pela experiência. Isto foi conseguido pela determinação dos valores de espessura de bileter (h) a partir de três procedimentos independentes: medidas de capacitância elétrica (hc) , medidas de reflectância óptica (hr) , e cálculo direto (hav). Tanford (1980) calculou a espessura do bico usando a seguinte fórmula hav = Nl M/ρ, onde Nl, M e ρ são o número de lipídios por unidade de área, o peso molecular das cadeias hidrofóbicas e a densidade da zona hidrofóbica, respectivamente. Devido às “flutuações de espessura” das regiões hidrofóbicas, hc deve ser igual a ter, enquanto, neste caso, ambas devem ser menores que hr pela espessura da camada polar (htp): hc ≅ hav = hr-htp. Se o bico lipídico tivesse uma espessura uniforme, então hc deveria ser igual a ter. No caso do BLM composto por uma mistura binária de lipídios, uma associação seletiva entre os fosfolípidos ocorre após o aparecimento dos domínios dos fosfolípidos. A sua espessura depende do comprimento da cadeia de hidrocarbonetos dos componentes lipídicos . Popescu et al. (1991) demonstraram o aparecimento de poros estocásticos nos BLMs devido a flutuações na espessura do bocal. A altura da barreira energética para perfuração da membrana após tal mecanismo é grande (cerca de 91 kT, onde k e T são a temperatura constante e absoluta de Boltzmann, respectivamente). Neste caso, o perfil geométrico do poro é de uma forma toroidal elíptica. Foi também demonstrado que tal poro transmebrano poderia evoluir para um estado estável. Os resultados obtidos por este modelo foram bastante surpreendentes, devido à rápida escala de tempo para o fechamento dos poros estatísticos nas membranas. Dois anos mais tarde, Zhelev e Needham (1993) criaram poros grandes e quasi-estáveis em vesículas de bílis lipídicos, mantendo assim a previsão do modelo anterior. A resistência da membrana à ruptura em termos de tensão de linha para um grande poro em vesículas de bílis foi calculada por Moroz e Nelson (1997) .
Os poros transmembranas estocásticas também podem ser formados por movimentos térmicos tendenciosos dos lipídios . Este mecanismo é às vezes chamado de termoporação. Os poros aparecem na membrana através de um processo de ativação termicamente induzido. Alternativamente, o processo de ativação para a formação de poros pode ser induzido através de um campo elétrico externo (também chamado de eletroporação) . O poro gerado pela eletroporação é maior e mais estável . O mecanismo de eletroporação foi proposto para a entrega de drogas e genes às células e tecidos .
Os poros da proteína transmembrana são formados por sistemas proteináceos cobrindo uma ampla gama desde pequenos canais peptídeos (por exemplo, gramicidina, alamethicina, melitina, etc.) até grandes canais de montagem de proteínas multiméricas. Como esses poros são grandes e cheios de água, as substâncias hidrofílicas, incluindo íons, podem se difundir através deles, dissipando assim o potencial elétrico da membrana. Os poros da proteína transmembrana são constituídos por proteínas integrais de duas grandes classes estruturais: (1) canais seletivos formados por estruturas transmembrana a-helical agrupadas, e (2) canais seletivos, poros e poros formados por estruturas monoméricas (ex. OmpG), diméricas (ex. canais seletivos Cl-), triméricas (ex. OmpF) ou transmembrana ß-estrutura de barris multiméricos (ex. α-hemolysina, leucocidinas, citólisinas) . O bocal lipídico pode ser usado como um sistema in vitro para estudar esses canais de proteínas quando eles são reconstituídos em uma membrana funcional . Além disso, os BLMs podem ser usados como uma ferramenta para a engenharia de proteínas de membrana e suas aplicações tanto na área biofísica monomolécula quanto na área biotecnológica .
Em outro exemplo, a colicina Ia, uma proteína secretada pela Escherichia coli, forma canais de íons em tensão tanto na membrana interna da bactéria alvo quanto nos BLMs planares . A colicina Ia é uma membrana transportadora pertencente à classe das toxinas bacterianas que partilham a mesma estratégia: são inseridas na membrana das outras bactérias concorrentes dos nutrientes, gerando poros de grandes dimensões. Assim, estes poros irão danificar o potencial eletroquímico da membrana e, finalmente, provocarão a morte destas bactérias concorrentes. Em comparação com os poros estocásticos acima mencionados, os poros proteicos têm um mecanismo de formação diferente e também diferentes propriedades. Enquanto um poro estocástico “esquece” seu mecanismo de geração, alguns dos poros da proteína transmembrana (ex. colicina Ia) parecem exibir efeitos de “memória”, pelo menos sob a influência de uma seqüência específica de pulsos usados para estimulação elétrica BLM .
Poros genéticos foram encontrados na parede dos vasos sinusoidais do fígado dos mamíferos. As células endoteliais desses vasos possuem numerosos poros de placa de peneira. Estes poros de cerca de 0,1 μm de diâmetro permitem a passagem de uma parte do plasma sanguíneo e dos quilomícrons do espaço sinusoidal para o espaço de Disse. Portanto, os poros endoteliais controlam a troca de fluidos, solutos e partículas entre o sangue sinusoidal e o espaço de Disse .
Neste trabalho, usamos a teoria da elasticidade dos meios contínuos para descrever o aparecimento de poros estocásticos através de BLMs planares.