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Abstract

Objetivo. Embora o valor do Ki-67 tenha sido reconhecido no câncer de mama, também existe controvérsia. O objetivo deste estudo é mostrar o valor prognóstico do Ki-67 segundo a expressão do receptor de progesterona (PgR) em pacientes com receptor de estrogênio (ER-) positivo, receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2- (HER2-) negativo no câncer de mama precoce. Métodos. Foram revisados os registros de pacientes com câncer de mama invasivos não-metastáticos que foram operados em uma única instituição entre 2009 e 2012. O ponto final primário foi a sobrevida livre de recorrência (RFS) e o ponto final secundário foi a sobrevida global (SO). Ki-67 e PgR foram avaliados com imuno-histoquímica para o tumor após a cirurgia. Resultados. Um total de 1848 pacientes foram inscritos neste estudo. 223 (12%) pacientes tiveram alta (≥10%) Ki-67, e 1625 (88%) tiveram baixa expressão de Ki-67. Na expressão alta vs. baixa de Ki-67, foram observados significativamente piores RFS e OS somente quando a PgR foi baixa (<20%) ( e 0,005, respectivamente, para RFS e OS). Não houve diferença significativa na expressão RFS e OS de acordo com Ki-67 quando o PgR era alto ( e 0,076). Foram comparadas as RFS de quatro grupos de acordo com a expressão Ki-67 e PgR alto/baixo. O grupo de expressão baixo PgR e alto Ki-67 mostrou pior resultado entre eles (). Em uma análise multivariada, Ki-67 alto foi um fator prognóstico independente quando o PgR foi baixo (FC 3,05; IC 95% 1,50-6,19; ). Conclusões. Ki-67 teve um valor como fator prognóstico apenas sob baixo nível de expressão do PgR no câncer de mama precoce. O PgR deve ser considerado na avaliação do prognóstico de pacientes com câncer de mama usando Ki-67.

1. Introdução

O prognóstico de pacientes com câncer de mama é altamente variável e depende de várias características. Os cânceres de mama representam um grupo heterogêneo de tumores com diferenças histopatológicas, imunohistoquímicas (IHC) e genéticas. As características clínico-histopatológicas têm sido usadas há muito tempo para estimar o prognóstico e decidir sobre os planos de tratamento. Abordagens substitutivas que utilizam testes de IHC amplamente disponíveis para o receptor de estrogênio (ER), receptor de progesterona (PgR), receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2) e Ki-67 têm sido desenvolvidas desde então. Recentemente, a informação genómica foi integrada na clínica para prever o prognóstico do cancro da mama e decidir sobre o tratamento sistémico. No entanto, devido aos elevados custos e questões técnicas, os testes genéticos podem não estar disponíveis em grande parte do mundo. Os papéis dos biomarcadores ainda são importantes para determinar se o paciente se beneficiaria de um determinado tratamento.

Proliferação aumentada é uma marca registrada de tumores malignos e é um parâmetro essencial para a previsão da resposta terapêutica . Ki-67 é um índice proliferativo representativo. Muitos estudos têm usado Ki-67 como um presuntivo marcador preditivo independente para o tratamento com valor prognóstico para o resultado clínico, bem como livre de doenças e sobrevivência geral . Entretanto, há também uma controvérsia sobre o uso de Ki-67, com alguns estudos sugerindo que Ki-67 não tem valor prognóstico .

O Consenso de Saint Gallen reconheceu uma distinção entre tumor “luminal tipo A” e “luminal tipo B” e apoiou o valor de Ki-67 para a informação prognóstica robusta que ele transmite . O desenvolvimento da análise multigene permitiu definições mais refinadas dos subtipos de câncer de mama. Os pacientes com tumores luminais A baseados em IHC no grupo de PgR baixo tiveram sobrevida significativamente mais pobre sem doenças do que os do grupo de PgR alto . Um estudo anterior relatou que 51,3% dos tumores luminais A baseados em IHC com expressão de PgR ≤20% estavam dentro da classificação intrínseca de luminal B, e que apenas 30,9% dos tumores luminais B baseados em IHC com expressão de PgR >20% eram na verdade tumores luminais B intrínsecos. Assim, a classificação baseada em PgR dos subtipos luminais utilizados clinicamente é algo imprecisa e a combinação desta classificação com a expressão Ki-67 pode melhorar a precisão diagnóstica.

O objetivo deste estudo foi esclarecer o valor prognóstico independente da determinação da expressão Ki-67. Para tanto, investigamos a relação entre os níveis de expressão de Ki-67 e PgR na prática clínica e correlacionamos a expressão desses marcadores com as variáveis clinicopatológicas.

2. Materiais e Métodos

2.1. População do Estudo

Os registros de 1848 pacientes com câncer de mama invasivo patologicamente confirmado, submetidos à cirurgia no Departamento de Cirurgia do Hospital Universitário Nacional de Seul (SNUH; Seul, Coreia do Sul), entre julho de 2009 e dezembro de 2012, foram coletados retrospectivamente. Foram incluídas pacientes com cancro da mama com ER positivo e HER2-negativo, independentemente do estatuto de PgR. Foram excluídas as pacientes diagnosticadas com carcinoma in-situ ou metástase à distância no diagnóstico inicial ou que tenham sido previamente operadas ao cancro da mama, bem como aquelas para as quais não existiam dados sobre PgR ou Ki-67. Não excluímos pacientes que foram submetidos a terapia sistêmica neoadjuvante. A análise do IHC foi realizada a partir do tecido, utilizando biópsia do núcleo em um diagnóstico. Se a informação dos tecidos iniciais era insuficiente, utilizamos cortes permanentes nos pacientes que não receberam tratamento sistêmico neoadjuvante. A biópsia foi obtida de pacientes que foram submetidos à terapia sistêmica neoadjuvante antes do tratamento. A população do estudo foi composta por pacientes com diagnóstico de estágio I a IIIC de acordo com o sistema de estadiamento patológico AJCC (American Joint Committee on Cancer, 8ª edição). A recidiva foi dividida em locorregional e distante. A recidiva contralateral não foi incluída entre as categorias recorrentes neste estudo. O ponto final primário foi a sobrevivência livre de recorrência (RFS) em relação ao estado de expressão Ki-67 e PgR. O período de seguimento correspondeu ao intervalo entre a cirurgia e a última data de uma visita hospitalar, independentemente do departamento visitado. O ponto final secundário foi a sobrevida global (SO). Para os acompanhamentos, os prontuários eletrônicos dos pacientes foram revisados até novembro de 2015; os óbitos foram registrados com base em relatos de dezembro de 2013. A RFS foi classificada em quatro grupos com base em correlações com a expressão Ki-67 e PgR.

2,2. Procedimento do IHC

ER, PgR, HER2 e expressão Ki-67 foram determinados pelo IHC em blocos de tecido fixados em formol e incluídos em parafina. Os níveis de expressão dos receptores hormonais, HER2 e Ki-67 foram avaliados pela técnica do complexo avidina-biotina. Os tecidos foram cortados em 4 cortes de espessura μm, desparafinizados com xileno, reidratados com uma série de etanol graduado e imersos em solução salina com Tris-buffered. Os cortes representativos foram imunes, e mais de 10 campos de visão de alta potência foram selecionados aleatoriamente e examinados sob um microscópio óptico. Após a recuperação do antígeno, os cortes foram incubados com anticorpos primários contra ER (1DO5; Dako, Dinamarca; 1 : 50), PgR (PgR636; Dako; 1 : 50), HER2 (CB11; Novocastra Laboratories, upon-Tyne, UK; 1 : 200), e Ki-67 (MIB-1; Dako; 1 : 800) nas diluições indicadas. As secções foram então incubadas com o anticorpo secundário biotinylated anti-mouse e coradas com peroxidase de estreptavidina de rábano (Zymed Laboratories, San Francisco, CA, EUA). As secções foram contra-manchadas com hematoxilina de Mayer, desidratadas, desobstruídas e depois montadas para exame. As amostras de IHC foram analisadas por um patologista experiente no SNUH. O valor de corte utilizado para definir a expressão baixa versus alta de Ki-67 foi a presença de imunoreatividade de Ki-67 em mais de 10% dos núcleos corados nos tecidos tumorais. O corte de 10% para Ki-67 foi considerado como tendo o melhor valor preditivo para o prognóstico no SNUH. Os pacientes foram divididos em tumores com baixa (<20%) e alta (≥20%) expressão PgR. O corte do PgR de 20% baseia-se na Conferência Internacional de Câncer de Mama de Saint Gallen de 2013 .

2,3. Análise estatística

Patientes foram divididos em grupos de Ki-67 baixo e alto e grupos de PgR baixo e alto. As características clínico-opatológicas foram avaliadas usando todas as comparações de pares dos grupos. As variáveis categóricas foram comparadas utilizando o qui-quadrado ou o teste exato de Fisher. O teste t de Student foi usado para comparar variáveis contínuas entre dois grupos. RFS foi definido como o intervalo entre a data da operação e a data da primeira observação de uma recorrência ou a data do último acompanhamento sem evidência de recorrência. O SO foi definido como o intervalo entre a data da operação e a data do óbito ou do último seguimento. As taxas de sobrevivência foram estimadas usando o método de Kaplan-Meier, e as diferenças entre dois grupos foram comparadas usando o teste de log-rank. Nas análises univariadas e multivariadas das taxas de sobrevivência, a regressão de risco proporcional de Cox foi utilizada com ajuste para vários fatores. As análises de regressão de Cox foram usadas para calcular os índices de perigo (FCs) e intervalos de confiança de 95% (ICs). Os valores foram bifacetados e a significância estatística foi definida como um valor <0,05. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SPSS, versão 21 para Windows (IBM Corp., Chicago, IL, EUA).

3. Resultados

3.1. Características clínico-patológicas dos pacientes

Um total de 1.848 pacientes foram inscritos neste estudo. As características clínico-patológicas dos pacientes analisados foram acessadas através da comparação entre subgrupos de expressão PgR baixa e alta e subgrupos Ki-67 baixa e alta. A média de idade foi de 49-52 anos em cada subconjunto. Cancros maiores (>2 cm) foram mais comumente associados com Ki-67 () alto e PgR baixo (). Amostras dicotomizadas de grau histológico (HG) em subconjuntos baixo e alto, com grau 3 estão sendo classificadas como alto e grau 1 + 2 é classificado como baixo. Amostras de Nodo-positivo e HG alto também foram identificadas em subconjuntos de Ki-67 e PgR baixo. Significativamente, mais casos com baixo PgR foram submetidos à quimioterapia neoadjuvante, independentemente do status de Ki-67. Além disso, mais pacientes com Ki-67 elevado foram submetidos à quimioterapia adjuvante, independentemente do estatuto de PgR. Também consideramos as características do tumor de acordo com o método de operação. Um total de 719 pacientes foram submetidos a mastectomia, sendo que um número maior destes pacientes teve baixa expressão de PgR do que alta expressão de PgR. Entretanto, não houve associação significativa entre os subconjuntos de Ki-67 e a freqüência da mastectomia. Apenas os subgrupos de PgR foram significativamente diferentes entre os tipos de cirurgia de axila. Recidiva, seja local ou distante, foi observada em 52 pacientes. A recidiva foi local em 10 casos e distante em 42 casos. Os achados de mortalidade são baseados em dados públicos do Ministério do Interior; até 2013 (último ano para o qual os dados de mortalidade foram examinados), 11 pacientes haviam morrido (Tabela 1).

RFS foi significativamente melhor para os pacientes do grupo de expressão baixa de Ki-67 do que para aqueles do grupo de expressão alta de Ki-67 (; Figura 1(a)). A RFS também foi significativamente melhor para o grupo de expressão PgR alta do que para o grupo de expressão PgR baixa (; Figura 1(b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 1

Recorrência-sobrevivência livre (RFS) de acordo com o índice Ki-67 e o estado da expressão do receptor de progesterona. (a) Pacientes em geral (n = 1848); RFS de acordo com Ki-67. (b) Pacientes em geral (n = 1848); RFS de acordo com a expressão do receptor de progesterona.

Interessantemente, uma análise do subconjunto mostrou que a RFS baseada no status da expressão de Ki-67 foi significativamente diferente no subconjunto PgR baixo mas não no subconjunto PgR alto. Especificamente, a RFS de pacientes com expressão de Ki-67 alta e PgR baixa (<20%) foi pior que a do grupo com expressão de Ki-67 baixa e PgR baixa (; Figura 2(a)). Pelo contrário, entre os pacientes do grupo com expressão de PgR alta (≥20%), não houve diferença significativa entre os grupos com Ki-67 alto e baixo (; Figura 2(b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 2

Recorrência-sobrevida livre (RFS) de pacientes com câncer de mama Ki-67 alto e baixo de acordo com o estado de expressão dos receptores de progesterona. (a) RFS de acordo com Ki-67 no subconjunto de expressão do receptor de progesterona baixa (PgR < 20%). (b) RFS de acordo com Ki-67 no subconjunto de expressão do receptor de progesterona alta (PgR ≥ 20%).

RFS foi analisado posteriormente correlacionando-o com subconjuntos divididos em quatro grupos baseados na expressão de Ki-67 e PgR. Os pacientes com baixa expressão PgR e alta expressão Ki-67 apresentaram o pior resultado em relação aos outros três grupos (; Figura 3).

Figura 3

A sobrevida livre de recorrência dos pacientes foi dividida em 4 grupos combinados entre a expressão do receptor Ki-67 e a expressão do receptor de progesterona.

Multivariate Cox regressão modelos mostraram que Ki-67 não foi significativamente associado com alto PgR estado de expressão, após ajuste para fatores incluindo Ki-67 grupo de expressão, idade, tamanho do tumor, estado nodal e HG (HR 2,03; IC 95% 0,61-6,72; ; Tabela 2). Para pacientes no subconjunto de PgR baixo, Ki-67 foi associado marcadamente com RFS (FC 3,05; IC 95% 1,50-6,19; ; Tabela 2). O tamanho da tumoração foi estatisticamente significativo com RFS em ambos os estados de PgR.

Estado PgR baixo Estado PgR alto HR (95% CI) HR (95% CI) Age 1.00 (0.97–1.03) 0.856 0.99 (0.95–1.04) 0.713 Tamanho do tumor ≥2 cm, <2 cm 7,20 (2,53-20,51) <0.001 5,40 (1,49-19,60) 0,010 Status nodais Sim, não 1.66 (0.79–3.45) 0.179 2.53 (0.94–6.77) 0.065 Ki-67 ≥10%, <10% 3,05 (1,50-6,19) 0,002 2,03 (0,61-6.72) 0,247 HG Alto, baixo 1,78 (0,85-3,72) 0,127 0,82 (0,28-2,40) 0.719

Tabela 2

Análise de regressão de Cox multivariada para sobrevivência sem recorrência.

Uma análise do ponto final secundário, OS, similarmente mostrou sobrevivência superior no subconjunto baixo de Ki-67 com baixa expressão de PgR (; Figura 4(a)) e nenhuma diferença significativa em OS entre os subconjuntos de Ki-67 no grupo PgR alto (; Figura 4(b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 4

Sobrevida global (SO) de pacientes em Ki-67 cancro da mama de acordo com o estado de expressão dos receptores de progesterona. (a) OS de acordo com Ki-67 no subconjunto de expressão do receptor de baixa progesterona (PgR < 20%). (b) RFS de acordo com Ki-67 no subconjunto de expressão do receptor de progesterona alta (PgR ≥ 20%).

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Tempo de sobrevivência livre de doenças do meio foram 70 meses no subconjunto PgR baixo/Ki-67 alto e 75 meses no subconjunto PgR alto/Ki-67 baixo. Os tempos médios de sobrevida global foram de 74 meses e 76 meses, respectivamente, para PgR baixo/Ki-67 alto e PgR alto/Ki-67 baixo.

4. Discussão

Aqui, avaliamos o valor de Ki-67 como fator prognóstico independente para recorrência e sobrevida em pacientes com câncer de mama não-metastático com tumores ER-positivos e HER2-negativos. Consistente com relatos anteriores, nosso estudo mostrou que a expressão de Ki-67 mostrou valor prognóstico significativo, mas demonstramos ainda que Ki-67 nem sempre é um fator prognóstico independente. Especificamente, Ki-67 teve valor como fator prognóstico somente no grupo de baixa expressão PgR. Em nosso estudo, uma comparação de RFS entre os quatro subgrupos de expressão revelou o pior prognóstico no subgrupo Ki-67 de PgR baixo e alto. E o subconjunto foi de 120 dos 1848 pacientes. Portanto, o tratamento ativo pode ser considerado em cerca de 6% dos pacientes. Em termos de previsão de prognóstico, nossos achados sugerem que a combinação do nível de expressão Ki-67 com o nível de expressão PgR melhora o valor preditivo. Allison et al. relataram uma forte correlação entre os escores de recorrência de Oncotype DX alto com grau 3 e a expressão de RP baixa a ausente e Ki-67 > 10% . Além disso, Thakur et al. demonstraram que o status alto de Ki-67 estava significativamente correlacionado com o grupo de risco de recorrência do Oncótipo DX mais alto (baixo versus alto, ) . Se uma análise genômica não estiver disponível, a paciente de baixa PgR e alta expressão de Ki-67 no tratamento ativo pode ser considerada no grupo ER-positivo e HER2-negativo de câncer de mama. No entanto, é necessário mais trabalho, incluindo validação independente e possivelmente um estudo prospectivo, antes que estes achados possam ser levados à tradução clínica.

O nosso trabalho levanta várias questões adicionais. Embora o Ki-67 tenha sido estudado como um marcador prognóstico no cancro da mama durante mais de duas décadas, existem controvérsias em torno dos métodos utilizados para determinar a sua expressão e a validade analítica global dos resultados publicados. A validade analítica refere-se à capacidade de um teste para produzir resultados reprodutíveis e precisos. Para que um marcador tenha valor prognóstico e preditivo, um ponto de corte “ótimo” baseado em evidências é essencial. Assim, um motivo de controvérsia em torno do uso do Ki-67 como marcador é a ausência de um valor de corte padrão universalmente aceito, o que resultou no uso de diferentes valores limiares específicos por diferentes laboratórios. A nossa instituição demonstrou anteriormente que um valor de corte de 10% proporciona os melhores resultados prognósticos-previsão. Este valor é diferente do valor de corte apresentado no Consenso de Saint Gallen, que em 2011 definiu os tumores de “baixa proliferação” como aqueles com índice Ki-67 <14% , um corte estabelecido por comparação com o teste molecular multigene intrínseco PAM50 para classificação do câncer de lumina. Durante a Conferência de Saint Gallen de 2013, a maioria dos membros do painel votou para aumentar o limiar indicativo do elevado estatuto de Ki-67 para ≥20%. A definição final de um único ponto de corte pelo Consenso de Saint Gallen permaneceu indefinida, devido à contínua distribuição do Ki-67 e às barreiras analíticas e pré-analíticas à avaliação padronizada . O corte usado pelo nosso instituto é apropriado para a nossa pesquisa, mas as discussões sobre a padronização das avaliações Ki-67 para reduzir ainda mais a variabilidade interobservador continuarão. É necessário analisar se os resultados reportados em termos do valor prognóstico de Ki-67 seriam recapitulados se 14% ou 20% fossem utilizados em vez de 10%. Quando o valor de corte de Ki-67 foi definido para 14%, não houve diferença de acordo com Ki-67. RFS por Ki-67 não teve significância estatística (; apêndice 1) nem mostrou a diferença entre Ki-67 baixo e Ki-67 alto de acordo com os subconjuntos de expressão PgR (; apêndice 2a, ; apêndice 2b). A melhor estratégia é usar Ki-67 como marcador contínuo, refletindo a biologia da proliferação tumoral. Além disso, a decisão de tratamento de pacientes individuais não deve depender de pequenas diferenças de Ki-67 em torno de um determinado ponto de corte.

Ao nosso conhecimento, este é um dos maiores estudos retrospectivos para analisar dados de um registro clínico de câncer de alta qualidade sobre o uso rotineiro e significado prognóstico do Ki-67. Embora retrospectivo, tem a vantagem de compreender uma população de câncer de mama não-metastático, não-selecionada, sem viés de seleção. Notadamente, as análises de patologia e biomarcadores foram realizadas prospectivamente em um único laboratório acreditado e, portanto, representam uma avaliação “real” do valor do IHC na prática clínica.

Embora as várias limitações do Ki-67 como marcador, seu uso clínico no campo do câncer de mama tem sido adotado por várias razões. É utilizado para distinguir tumores luminosos e é considerado um fator prognóstico. Avaliar o Ki-67 pelo IHC é barato e fácil de implementar sem investimentos em equipamentos sofisticados, levando ao conceito atraente do Ki-67 como um biomarcador de baixo custo. A importância da flexibilidade clínica é fundamental, dadas as incertezas que envolvem a adaptação de diferentes opções de quimioterapia a cada caso, destacando a importância de estabelecer um papel mais preciso para o Ki-67.

Neste estudo, descobrimos que o Ki-67 é um marcador prognóstico eficaz apenas no contexto de um baixo PgR. Descobrimos ainda que pacientes com baixo PgR e alta expressão de Ki-67 tinham o pior prognóstico em termos de RFS. De uma perspectiva global, as assinaturas genómicas continuarão a ser de difícil acesso num futuro previsível para a maioria dos pacientes. O tratamento ativo pode ser considerado como o padrão nos casos de câncer de mama com ER precoce positivo e HER2 negativo que satisfazem as condições de baixo PgR e alto Ki-67.

5. Conclusões

Nossos resultados mostram que o Ki-67 tem valor prognóstico de recorrência e sobrevida em pacientes com câncer de mama precoce ER-positivo e HER2-negativo somente no contexto de baixo nível de expressão de PgR. Assim, a expressão do PgR também deve ser considerada na avaliação do prognóstico de pacientes com câncer de mama usando Ki-67.

Dados Disponibilidade

Os dados demográficos e clínicos coletados para fins de análise estatística para apoiar os achados deste estudo estão disponíveis no autor correspondente mediante solicitação.

Conflitos de interesse

Os autores declaram que não há conflitos de interesse em relação à publicação deste trabalho.

Materiais complementares

Anexo 1: sobrevivência sem recorrência (RFS) de acordo com o índice Ki-67 por um valor de corte de 14%. Apêndice 2a: sobrevivência livre de recorrência (RFS) de acordo com Ki-67 (valor de corte de 14%) no subconjunto de receptores de baixa progesterona. Apêndice 2b: RFS de acordo com Ki-67 (valor de corte de 14%) no subconjunto de receptores de progesterona alto. (Materiais Suplementares)