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The P74-26 Major Capsid Protein usa características arquitetônicas únicas -assos, anéis e abas – para melhorar a estabilidade da cápside. Observamos interações hidrofóbicas aprimoradas nas interfaces subunidade-subunidade dentro do capsid. As interações hidrofóbicas são estimadas em >2 vezes mais altas para P74-26 do que para outros homólogos mesófilos (Tabelas Suplementares 3 e 4). Esta observação pode explicar parcialmente o aumento da termoestabilidade do capsido P74-26, uma vez que o efeito hidrofóbico aumenta a resistência a altas temperaturas32. Em contraste, não observamos alteração significativa no número de ligações de hidrogênio ou pontes de sal (Tabelas Suplementares 3 e 4), outras interações que foram vistas como conferindo termoestabilidade para algumas proteínas globulares33,34,35,36,

Não ficamos particularmente surpresos ao encontrarmos interações hidrofóbicas aumentadas no capsid P74-26. Numerosos estudos de proteínas globulares termofílicas mostram o aumento das forças hidrofóbicas como um grande contribuinte para a estabilidade térmica33,37,38,39,40. Entretanto, há duas coisas que fazem do capsid P74-26 um sistema modelo único: (1) a alta pressão interna do ADN fortemente empacotado induz stress mecânico no capsid7,8,27 e (2) é uma estrutura de auto-montagem na qual a arquitectura e topologia inter-subunidades desempenham um papel importante na estabilidade geral. Podemos derivar estes princípios comparando a estrutura P74-26 com a de numerosos homólogos mesófilos.

Verificamos que o capsido P74-26 é estabilizado por vários loops e extensões que formam ligações topológicas entre as subunidades. O exclusivo laço E-loop se liga ao G-loop e ao P-domínio de um MCP vizinho, que atuam como um poste de engate para amarrar topologicamente o laço. Além disso, os braços N e C, em conjunto com o braço Dec, tocam completamente as cordas E-loop β, outro elemento arquitectónico único no P74-26 (Fig. 5e). Assim, o laço E é anelado em direção à base e laço em direção à ponta.

Um segundo laço é formado pelo N-arm, que forma interações intra e inter-capsômeros. O N-arm liga-se ao laço E de um MCP vizinho dentro de um capsomer através do cordão superior do braço, da hélice do antebraço e da região da mão (Fig. 5a, c). Além disso, o cotovelo, o antebraço e a mão estabilizam as interações capsomer-capsomer por ligação com DecP74-26 e uma subunidade de MCP que se encontra sobre os eixos duplo/quase-duplo (Fig. 6a, b). Enquanto o N-arm não é tecnicamente um loop fechado, P74-26 fecha efetivamente o loop usando o exclusivo S-loop para fixar a posição das regiões do antebraço e da mão (Fig. 6c). Não encontramos uma arquitetura similar de laço N em Caudovírus mesófilos31,41,42,43,44,45,46, o que sugere que esta arquitetura é importante para melhorar a estabilidade do capsidro.

Embora os lassos não sejam encontrados em outros Caudovírus, os herpesvírus distantemente relacionados contêm uma arquitetura de laço análoga no braço N da dobra HK9747,48,49. Assim como o N-arm do P74-26, os lassos do N-arm do herpesvírus não são verdadeiros laços fechados. Apesar desta aparente semelhança, o herpesvírus lassos funciona de forma diferente. Eles estabilizam exclusivamente as interações inter-capsômeros, enquanto o laço N-braço do P74-26 estabiliza tanto as interações intra-capsômero quanto as inter-capsômeros. Além disso, os pentons dos capilares do herpesvírus não apresentam interações lassas e as interações são variáveis dentro das subunidades do hexônio, enquanto o P74-26 tem interações lassas quase idênticas em ambos os pentons e hexônios. Essas observações indicam que a arquitetura do laço provavelmente evoluiu independentemente e destaca a flexibilidade dos mecanismos de estabilização topológica. Hipotecamos que a arquitetura de braço extensível facilita a evolução de interações mais fortes dentro de sistemas de auto-montagem, tais como capsids. Estes loops abertos podem ser facilmente melhorados através da extensão serial de um único resíduo. Talvez esta facilidade de evolução seja a razão pela qual os lassos de braço estendido são encontrados tanto em P74-26 como em herpesvírus. Estes lassos estendidos são semelhantes às extensões terminais N e C que medeiam a montagem em outros vírus (ou seja, extensões terminais C em proteínas SV40 capsid coat50). Nós antecipamos que estes tipos de lassos estendidos podem ser úteis para a engenharia de capsids mais estáveis e outras partículas de auto-montagem.

Uma outra vantagem da arquitetura do laço é que ele pode adotar uma conformação menos estendida. P74-26 MCP tem dois lassos em ambas as extremidades da dobra HK97, ambos presumivelmente presentes no procapsid muito menor. Ao utilizar estas estruturas de laço, o P74-26 pode manter uma alta estabilidade, enquanto proporciona flexibilidade conformacional para se expandir durante a maturação. Hipotecamos que os lassos são menos estendidos no procapsid; na expansão do capsid, os lassos atingem sua extensão total, onde se fixam no lugar. A extensão total observada no capsid maduro forneceria integridade tensional, como discutimos abaixo.

P74-26 utiliza abas entrelaçadas para estabilizar topologicamente os contatos inter-capsomer. O laço em T estabiliza as interações entre capsômeros inserindo em uma ranhura no domínio P de uma subunidade MCP em um capsômero vizinho. Essas interações em T loop são encontradas anelando os eixos triplo/quasi-três vezes ao longo da face interna da capa (Fig. 7b; Suplemento Fig. 7b). Da mesma forma, as interações inter-capsomer duas vezes/quasi-duas vezes são estabilizadas na face externa da cápsula pela disposição intercalada dos N-armamentos (Fig. 7c; Suplemento Fig. 7a). Estas estruturas sobrepostas assemelham-se à disposição intercalada de abas na parte superior de uma caixa móvel. Desta forma, as faces externas e internas da tampa são estabilizadas por duas interações de abas intercaladas separadas. Propomos a disposição da caixa móvel vista em eixos simétricos e quase-simétricos que reforçam muito a tampa contra a pressão interna porque são topologicamente difíceis de interromper. Entretanto, estes arranjos também são presumivelmente desafiadores de montagem, o que levanta a importante questão de como o capsid P74-26 se monta com uma arquitetura intercalada.

A proteína de decoração P74-26 também adota um arranjo estrutural único, contribuindo substancialmente para a termoestabilidade do capsid. As proteínas de decoração aumentam a estabilidade do capsid28,29,51, embora tenham sido postulados papéis adicionais52. Os eixos triplo/quasi-três são estabilizados pelo trimer DecP74-26. Comparado ao Caudovírus mesofílico, o trimer DecP74-26 interage com mais subunidades em uma área de interação muito maior (Fig. 8a). A área total de interação por subunidade DecP74-26 é bastante notável: ~4100;Å2 para uma proteína de 146-resíduos. Nosso estudo anterior mostrou que o DecP74-26 é substancialmente mais estável que seus homólogos mesófilos, e esta estabilização se dá principalmente através da formação de um trimeiro extraordinariamente apertado23. Entretanto, as interações de trimerização representam apenas uma pequena fração da área total de interação DecP74-26 (~18% da área total de interação por subunidade DecP74-26). Isto sugere que a interação DezP74-26 com o capsid contribui com uma quantidade substancial de estabilidade.

Interações entre os trimestres de DezP74-26 formam uma gaiola que mantém o capsidro unido (Fig. 8b). Este arranjo é exclusivo de P74-26. Por exemplo, os fagos lambda e TW1 usam uma dobra de Proteína de Decoração muito semelhante23 , mas a interação de seu Dec-arm com outras proteínas do capsid é muito mais limitada29,44. Além disso, a proteína decorativa não relacionada do fago L não se conecta com os trimers vizinhos, e na verdade está ausente nos eixos quase triplos52. O fago T4 é decorado com a proteína Soc que interage com as subunidades vizinhas Soc nos eixos tríplice e quasi-três; no entanto, Soc está presente em ocupação relativamente baixa (~50%), portanto a gaiola está incompleta41. Como as proteínas de decoração estão normalmente ausentes no procapsid29, esperamos que a gaiola DecP74-26 se reúna cooperativamente na expansão do capsido para estabilizar o capsido. Experiências futuras irão interrogar o papel da cooperatividade na montagem e estabilidade.

As melhorias arquitetônicas em P74-26 MCP e Dec proporcionam estabilização contra alta pressão interna. Como as forças da pressão interna atuam sobre o capsid, e como a arquitetura do capsid resiste a essas tensões? Se assumirmos que a pressão do DNA encapsulado é distribuída uniformemente em torno do capsido isométrico, então todos os pontos do capsido experimentam um vector de força que é perpendicular à superfície do capsido. Por analogia, o capsido está experimentando forças que são semelhantes às de um balão. Assim, a pressão interna causa tensões laterais nas interações capsidiárias. Enquanto a alta pressão interna exibida pelo fago desafia a estabilidade da cápside, ela pode permitir mecanismos de estabilidade que dependem da tensogridade. É possível que a pressão interna possa ser aproveitada para produzir uma partícula estabilizada pela tensão sobre as subunidades individuais. Em apoio a isto, os capsids do picornavírus, que enfrentam uma pressão interna consideravelmente menor, podem ser estabilizados por pequenas modificações no capsid53.

A arquitetura do capsid P74-26 é construída para suportar tensões laterais através da integridade tensional. A integridade tensional, ou tensogridade, é um mecanismo generalizado de estabilidade arquitetônica que envolve regiões estruturadas mantidas juntas por uma rede de elementos flexíveis que estão sob tensão contínua54. No capsidão P74-26, os domínios A e P são as regiões estruturadas, e os lassos e braços estendidos são os elementos flexíveis que transmitem a tensão. Por exemplo, o laço E-loop ficará esticado contra o poste de engate formado pelo laço G e o dominio P do vizinho. Da mesma forma, o braço N forma um laço cuja extremidade é mantida no lugar pelo laço S que se prende na ranhura entre o antebraço e a mão (Fig. 6c). Assim, prevemos que o S-loop exibirá as marcas de um laço de captura, um laço não covalente que se torna mais forte sob tensão55. Além disso, o capsidro P74-26 contém várias abas que se entrelaçam entre si. Estas interações resistiriam topologicamente às tensões laterais e longitudinais da pressão interna. Como um todo, estes elementos de laço e aba utilizam a tensão para resistir a falhas estruturais do capsido. O mecanismo de tensão observado aqui é simplesmente um exemplo mais elaborado de tensão lateral sugerido pela Caspar há muitos anos56,

As interações laço, flap e braço são posicionadas de tal forma que a pressão interna distribui a tensão através de múltiplas ligações. Por exemplo, o laço E-loop β- folha experimenta forças ao longo do eixo da folha. Assim, todas as ligações que mantêm a folha unida estão sob tensão em vez da geometria ortogonal na qual a tensão está apenas sobre as ligações no final da folha. Uma falha de capsidria exigiria a ruptura simultânea de muitas ligações (uma geometria de cisalhamento), em vez de uma geometria de descompactação na qual as ligações se rompem uma de cada vez57. Estudos pioneiros com uma única molécula mostraram que uma geometria de cisalhamento requer forças muito maiores para romper do que quando as forças atuam em uma geometria de descompactação58,59,60. Assim, o capsid P74-26 é construído de tal forma que as forças laterais atuam em uma geometria de cisalhamento, resultando em alta tensão.

Além da arquitetura única de estabilização do capsid, o P74-26 também adota um mecanismo não-canônico para alterar a capacidade do capsid. O capsido do P74-26 é maior do que na maioria dos Caudovírus, o que se correlaciona com o seu genoma anormalmente grande. A maioria dos T = 7 Caudovírus tem tamanhos de genoma entre 30 e 50 kb (Tabela Complementar 2), enquanto o genoma do fago P74-26 é quase duas vezes maior a 83 kb24. Baseado no tamanho do genoma nós previmos que o tamanho do genoma seria T = 12 (tamanho médio do genoma ~80 kb61), embora T = 9 ou T = 13 teria sido possível (tamanho médio do genoma ~70 ou ~120 kb, respectivamente). O capsid P74-26 atinge este tamanho maior ao aumentar significativamente o tamanho do capsomer em vez de mudar a complexidade icosaédrica. O capsomer é maior porque o P74-26 MCP cobre mais área de superfície do que o normal, apesar de um comprimento típico para MCP. Consequentemente, o capsômero é ligeiramente mais fino do que o normal (Fig. 4b). Assim, o número de resíduos no MCP não prevê a área total coberta, e o tamanho do genoma não prevê o número de triangulação.

Recentemente, Bayfield et al.62 determinaram a estrutura de um fago termófilo T = 7 intimamente relacionado, que similarmente utiliza capsômeros aumentados para aumentar a capacidade de capsidulação. Para nosso conhecimento, este é um mecanismo não-canônico para aumentar a capacidade de capsid. Existem dois mecanismos clássicos para aumentar a capacidade de um capsid: (1) aumento do número de triangulação e (2) conversão de uma cabeça isométrica em cabeça alongada. No primeiro caso, são adicionados hexões em todas as faces do capsido, enquanto no segundo, são adicionados hexões em dez das faces icosaédricas de tal forma que o capsido é alongado em uma dimensão (Fig. 9). Em ambos os casos, os capsómeros permanecem com o mesmo tamanho. Aqui, identificamos um terceiro mecanismo de evolução de um capsid maior: aumentando o tamanho do capsidro.

Estes três mecanismos têm barreiras evolutivas muito diferentes. Os dois mecanismos clássicos podem ser implementados através de mutações simples e têm sido observados inúmeras vezes. Em muitos vírus, as mutações pontuais simples modificam o número de triangulação5,63,64. Além disso, o número de triangulação de alguns capsids pode ser alterado sem alterar a sequência de MCP3,65,66. Da mesma forma, as mutações pontuais em fago T4 convertem o capsido do prolate para isométrico ou geram cabeças gigantes nas quais o longo eixo da cabeça prolate é alongado4,67. Portanto, as barreiras evolutivas para alterar o volume do capsid através dos dois mecanismos clássicos parecem ser bastante baixas. Em contraste, a estratégia do capsomer ampliado aqui identificada requer múltiplas e extensas alterações nas seqüências de proteínas capsidiais. O capsid maior P74-26 necessita de grandes alterações nas oito modificações separadas na estrutura do MCP, bem como no Dec-arm (Fig. 3a, b e 4c, d). Isto levanta a questão: por que o fago P74-26 utilizou esta estratégia evolutiva aparentemente mais desafiadora do que as estratégias clássicas e mais fáceis? Que constrangimentos impediram a evolução de um capsidão maior através das rotas clássicas?

A nossa primeira hipótese é que os lassos, abas e braços que estabilizam o capsid P74-26 requerem um capsomer maior para a função. É possível que os lassos necessitem de espaço extra para abrir o suficiente para que a estrutura de um poste de engate possa ser inserida. Da mesma forma, as abas e braços podem necessitar de um certo comprimento para estabilizar a sua actividade. Se este fosse o caso, então os elementos arquitectónicos que estabilizam a cápsula necessitam de capilares maiores do que os capilares normais. Neste cenário, o capsômero maior é a característica estrutural selecionada e a geometria T = 7 é um tímpano: uma estrutura biológica que é um subproduto da evolução e não um resultado da seleção direta68. Contudo, não favorecemos esta hipótese porque os lassos são encontrados no herpesvírus, no qual a dobra HK97 é um tamanho típico (os MCPs herpesvírus têm vários outros domínios de torres que aumentam de tamanho, mas estes domínios não fazem parte do piso principal do capsidro e não contribuem para a dobra HK9749). Além disso, outros Caudovirus MCPs contêm longas N-arms (por exemplo, Sf6 phage31) ou E-loops que são abertos quase tão largos quanto P74-26 (por exemplo, P22 phage43), mas estas proteínas são de tamanho típico. No entanto, esta hipótese permanece não testada.

Uma segunda hipótese é que o tamanho do genoma e a capacidade de capsidão coevoluíram através de pequenos aumentos concomitantes. Se o fago ancestral evoluiu um genoma ligeiramente maior do que pode ser acomodado no capsid, então pode haver uma pressão seletiva para um capsid ligeiramente maior. O aumento do número T ou a transição para uma cabeça alongada aumenta substancialmente o volume do capsido, resultando em grandes quedas na pressão interna. Estas transições podem ser desencorajadas porque a pressão interna precisa de ser mantida para a infecção26. Para evitar grandes mudanças na pressão interna, capsômeros maiores podem lentamente se desenvolver com um genoma maior.

Nossa hipótese final é que a geometria da cápside tem um efeito direto na estabilidade geral da cápside. Hipótese é que a geometria T = 7 é inerentemente mais estável do que números de triangulação mais altos devido a conformações variáveis dos hexônios. Todos os capsids que são T = 9 ou superiores têm mais de um tipo de hexônio presente, enquanto todos os capsids T ≤ 7 têm exatamente um tipo de hexônio (exceto T = 1, que não tem hexônios69,70). Por exemplo, T = 7 tem uma conformação de hexônio de um só pucker, enquanto T = 9 tem hexons tanto alados quanto planos (Suplemento Fig. 11a, b). Observamos também que os capilares prolacionados têm múltiplos tipos de hexons (geralmente três ou mais conformações de hexons; Fig. 9). Assim, as principais proteínas capsids em T > 7 vírus devem acomodar a heterogeneidade conformacional do hexônio, o que pode afetar adversamente a estabilidade.

Ponhamos a hipótese de que a geometria T = 7 é a mais alta complexidade (ou seja, o maior tamanho) que é inerentemente estável. Geometrias mais complexas introduziriam instabilidade através da variação da conformação do hexônio. Esta instabilidade inerente pode requerer mecanismos de estabilização extra para mitigar, tais como proteínas decorativas para cimentar a estrutura no local. Nós prevemos duas desvantagens nãoutualmente exclusivas da geometria T > 7. Primeiro, cada uma das conformações hexônicas separadas deve permanecer funcional e estável, o que restringiria a evolução das proteínas MCP para maior estabilidade. O segundo benefício é que um menor número de triangulações resulta em menos interfaces subunidade-subunidade, minimizando assim o número de pontos fracos no capsid. Em apoio a esta hipótese, o vírus extremofílico, archaeal HSTV-2 (Halorubrum sodomense tailed virus 2) empacota seu genoma ~68 kb em um T = 7 head71. O HSTV-2 utiliza um capsid maior que o normal, e também tem proteínas de decoração triméricas que se sentam nos eixos triplo/quasi-três. O facto deste mecanismo de ampliação do capsido só ter sido observado em extremófilos apoia a ideia de que a geometria T = 7 tem um efeito benéfico na estabilidade. Em apoio à nossa hipótese, todos os conhecidos T > 7 capsids usam proteínas decorativas (que sabemos), enquanto muitos vírus T = 7 não têm proteínas decorativas.

Se vários números de triangulação têm diferentes números de estabilidade inerente, isto sugere que cada geometria exibe pontos fracos em diferentes regiões do capsid, como foi previsto no trabalho teórico72. Hipótese é que os eixos triangulares/quasi-três representam os pontos fracos de uma malha T = 7. Em apoio a essa hipótese, proteínas decorativas de T = 7 Caudovírus são comumente encontradas nos eixos tríplice/quasi-trêspera (Tabela Complementar 2)29,44,52. Além disso, esses eixos são estabilizados por ligações cruzadas covalentes em fago HK9745 e flaps em T-loop em P74-26 (Fig. 7b). Para examinar esta idéia mais adiante, notamos que T = 9 fago também usam proteínas decorativas nos três eixos73,74, enquanto T = 12 e T = 13 fago usam proteínas decorativas nos centros dos capsômeros61,75,76.

Nós notamos que todas as nossas análises têm focado principalmente o Caudovirus. Esses vírus geralmente não quebram suas cápsulas como parte de seu ciclo de vida, portanto a cápsula não tem pressão seletiva para ser lábil. Na verdade, a alta pressão do DNA empacotado apresenta uma alta pressão seletiva para evoluir capsids estáveis. É provável que outros tipos de vírus utilizem mecanismos de estabilidade diferentes, particularmente vírus que desmontam as suas cápsulas como parte necessária do seu ciclo de vida.